Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium: metoda genetycznej transformacji genomu ryżu za pomocą genetycznie modyfikowanych Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens, bakteria chorobologiczna dla roślin, może być genetycznie modyfikowana poprzez wprowadzenie sztucznie przygotowanego plazmidu Ti, przenoszącego interesujący go gen w swoim transferowym DNA lub regionie T-DNA oraz plazmid pomocniczy przenoszący geny wirulencji lub Vir do przenoszenia T-DNA do komórek roślinnych.

W przypadku transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium zacznij od młodego kwiatostanu ryżu i pokrój go na małe kawałki. Przenieś sadzonki na pożywkę wzrostową i inkubuj, aby ułatwić wzrost sadzonek do niezróżnicowanej masy komórkowej zwanej kalusem.

Teraz przenieś kalus do pożywki infiltracyjnej Agrobacterium zawierającej acetosyringon - chemoatraktant dla Agrobacterium. Następnie dodaj kulturę genetycznie zmodyfikowanego Agrobacterium do pożywki i krótko inkubuj.

Cząsteczki acetosyringonu aktywują białko receptora komórkowego - VirA - na błonie Agrobacterium, które dodatkowo pośredniczy w fosforylacji białka aktywatora transkrypcji - VirG. Fosforylowany VirG przemieszcza się w kierunku plazmidu pomocniczego i aktywuje transkrypcję kaskady genów wirulencji, w tym białek kanałowych i endonukleaz - VirD1 i VirD2.

Białka kanałowe tworzą kanał transportowy łączący komórkę bakteryjną i roślinną, podczas gdy endonukleazy wiążą się z sekwencjami granicznymi w plazmidzie Ti i rozszczepiają T-DNA z VirD2, związanym na jednym końcu. Następnie VirD2 kieruje wejściem T-DNA przez kanał transportowy do komórek kalusa i ułatwia jego integrację z genomem ryżu.

Przetrzyj każdy kwiatostan wacikiem nasączonym 70% alkoholem i pozostaw do wyschnięcia przed ścięciem. Przynieś kwiatostan na sterylną ławkę laboratoryjną i pokrój go na małe kawałki wysterylizowanymi nożyczkami. Następnie przenieś zwiercinki na płytkę Petriego zawierającą pożywkę NBD2.

Inkubuj płytkę w ciemności w temperaturze 26 stopni Celsjusza przez 10 do 14 dni, aby wywołać modzel. Aby przeprowadzić transformację, przenieś pojedynczą kolonię z płytki YEB z selektywnymi antybiotykami do 5 mililitrów płynnej pożywki YEB zawierającej te same antybiotyki, w 50-mililitrowej stożkowej sterylnej probówce. Potrząśnij probówką na wytrząsarce orbitalnej o sile 250 x g i temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza, aż bakterie osiągną OD₆₀₀ 0,5.

Dodaj 1 mililitr zawiesiny bakteryjnej do 100 mililitrów pożywki YEB z tymi samymi selektywnymi antybiotykami, w stożkowej kolbie o pojemności 250 mililitrów i potrząsaj kolbą na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 250 x g i temperaturze 28 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Odwirować kulturę o sile 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zebrać bakterie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z pożywką AAM-AS i rozcieńczyć zawiesinę do OD₆₀₀ 0,4.

Po inkubacji zebrać około 150 zdrowych, jasnożółtych, embriogennych kalii do sterylnej kolby o pojemności 150 mililitrów. Dodaj 50 do 75 mililitrów zawiesiny komórek bakteryjnych do kolby, a następnie dodaj 10 do 25 mililitrów świeżej pożywki AAM-AS, aby zanurzyć kalię na 10 do 20 minut, od czasu do czasu wstrząsając.

Ostrożnie wylać zawiesinę bakteryjną z kolby i osuszyć kalusy sterylną bibułą filtracyjną. Następnie umieść je na szalce Petriego z pożywką NBD-AS i przykryj bibułą filtracyjną. Inkubuj kalisy w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza w ciemności przez trzy dni, sprawdzając je pod kątem przerostu bakterii.

Po trzech dniach wspólnej uprawy przenieś kalia na sterylną szalkę Petriego za pomocą bibuły filtracyjnej, a następnie wysusz je na powietrzu przez dwie godziny na czystej ławce. Upewnij się, że kalusy nie przylegają do bibuły filtracyjnej i przenieś je do głównego podłoża selekcyjnego NBD2.

Po dwóch tygodniach przenieś kalia równomiernie na nową płytkę zawierającą świeżą pożywkę selekcyjną. Następnie przenieś kalię na świeże podłoże MS w celu rozróżnienia, a pąki pędów na podłoże MS (z 10 mg/l higromycyny), aby rozmnożyć więcej pędów.