JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:59 min • July 8th, 2025
W celu dostarczenia plazmidowego DNA opartego na elektroporacji do pierwotnych komórek nerwowych, należy rozpocząć od zawieszenia komórek w odpowiednich podłożach do elektroporacji. Dodaj plazmidowe DNA kodujące białka fluorescencyjne, aby przygotować mieszaninę do elektroporacji.
Delikatnie przenieś mieszaninę elektroporacji do kuwety do elektroporacji, unikając pęcherzyków powietrza, które mogłyby negatywnie wpłynąć na wydajność elektroporacji. Przenieś kuwetę do uchwytu kuwety elektroporatora; Ustaw parametry elektroporacji. Rozpocznij elektroporację.
Przyłożone krótkie impulsy elektryczne o wysokim napięciu w poprzek błony komórkowej powodują akumulację ładunku różnicowego po obu stronach błony, zwiększając potencjał transbłonowy, czyli napięcie przez błonę komórkową.
Gdy indukowany potencjał transbłonowy przekracza potencjał rozpadu dwuwarstwy lipidowej, dwuwarstwa lipidowa destabilizuje się wraz z miejscową zmianą konfiguracji, tworząc przejściowe pory hydrofilowe na błonie komórkowej. Pory o odpowiedniej wielkości zapewniają drogę dla plazmidowego DNA do wniknięcia do cytoplazmy komórki.
Po zakończeniu elektroporacji dwuwarstwa lipidowa ponownie się uszczelnia, przywracając integralność dwuwarstwy błony komórkowej, zatrzymując w ten sposób plazmidowe DNA. Ponadto, w fazie cyklu komórkowego, gdy błona jądrowa, dwuwarstwowa błona otaczająca jądro, rozpada się, plazmidowy DNA przemieszcza się do jądra.
Płytki elektroporowane komórek do studzienek zawierających pożywkę na płytce wielodołkowej z szkiełkami nakrywkowymi pokrytymi białkiem. Inkubować, aby komórki mogły przylegać do szkiełka nakrywkowego pokrytego białkiem. Pomyślnie transfekowane komórki zawierające plazmidowe DNA wykazują ekspresję białek fluorescencyjnych.
Na początek dodaj 0,5 mililitra pożywki hodowlanej do każdej ścianki 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej powlekane szkiełka nakrywkowe i utrzymuj ją w cieple w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla. Odpipetować wymaganą liczbę komórek do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i wirować z prędkością 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach Opti-MEM. Powtórz tę procedurę dwukrotnie, aby upewnić się, że w probówce nie ma resztek pożywki hodowlanej. Ustaw parametry elektroporacji zgodnie z listą. Delikatnie odpipetuj reakcję elektroporacji, aby dobrze wymieszać, i użyj długiej końcówki pipety P200, aby przenieść dokładną objętość 100 mikrolitrów mieszaniny do kuwety o odstępie dwóch milimetrów.
Gdy kuweta znajdzie się w komorze kuwety, naciśnij przycisk omega elektroporatora i zanotuj wartość impedancji, przestrzegając dokładnej objętości 100 mikrolitrów. Zakres wartości impedancji powinien wynosić około 30 i 35.
Naciśnij przycisk Start, aby zainicjować impuls. Zapisz zmierzone wartości prądu i klejnoty pokazane na ramce odczytu. Wyjmij kuwetę z komory.
Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do kuwety i ponownie ją zawieś, pipetując w górę iw dół dwa do trzech razy. Natychmiast przenieść zawiesinę komórek na wcześniej przygotowaną płytkę 24-dołkową. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla.