Nukleofekcja form pasożytniczych: metoda transfekcji oparta na elektroporacji polegająca na dostarczaniu plazmidów kodujących białka fluorescencyjne do jądra sporozoitu

0 wyświetleń3:23 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby dostarczyć plazmidy do jąder sporozoitów przez nukleofekcję, należy rozpocząć od zawieszenia izolowanych, żywotnych sporozoitów - ruchliwego, zakaźnego stadium pasożytów - w buforze. Sporozoity to smukłe komórki otoczone zewnętrzną błoną plazmatyczną i leżącym pod nią kompleksem błony wewnętrznej, składającym się z szeregu spłaszczonych pęcherzyków i białek krytycznych dla stabilności strukturalnej i ruchliwości.

Odwirować zawiesinę w celu granulacji sporozoitów. Zawiesić osad sporozoitu w odpowiedniej objętości buforu transfekcji jądrowej, uzupełnionego plazmidami kodującymi białka fluorescencyjne. Bufor transfekcji jądrowej o wysokiej pojemności buforowej i sile jonowej zapewnia wydajną transfekcję przy zachowaniu funkcjonalności sporozoitu.

Przenieść zawiesinę do kuwety transfekcji jądrowej. Umieść kuwetę w uchwycie urządzenia do nukleofekcji. Uruchom odpowiedni program nukleofekcji.

Podczas nukleofekcji, specjalnie zastosowanej, krótkie impulsy wysokiego napięcia, wraz ze składnikami buforowymi, tymczasowo przerywają błonę plazmatyczną i kompleks błony wewnętrznej, tworząc pory transbłonowe, które zapewniają plazmidom dostęp do cytoplazmy.

Jednocześnie te pola elektryczne o wysokim natężeniu zakłócają również dwuwarstwową błonę jądrową otaczającą jądro, która tworzy przejściowe przerwy, ułatwiając bezpośrednie wejście plazmidów do jądra, bez potrzeby podziału komórki.

Po zakończeniu nukleofekcji pory błony komórkowej i jądrowej ponownie się uszczelniają, przywracając integralność błony i homeostazę, jednocześnie zatrzymując plazmidy wewnątrz jądra.

Wyjmij kuwetę z urządzenia. Dodaj odpowiednie podłoże do odzyskiwania sporozoitu i przenieś do świeżej probówki. Z powodzeniem nukleofektowane sporozoity plazmidowym DNA wykazują ekspresję białek fluorescencyjnych.

Najpierw odwirować zawiesinę sporozoitów lub merozoitów o stężeniu 600 x g przez 10 minut, a następnie odrzucić supernatant. W następującej kolejności dodaj 85 mikrolitrów buforu do transfekcji jądrowej, 10 mikrogramów plazmidu i 25 jednostek enzymu restrykcyjnego do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej sporozoity lub merozoity. Przenieść zawiesinę do kubka do transfekcji jądrowej.

Umieść kubek w rowku transferu jądra, włącz urządzenie do nukleofekcji za pomocą przycisku zasilania i wybierz procedurę transfekcji U-033. Po zakończeniu programu naciśnij przycisk X urządzenia do nukleofekcji, a na ekranie pojawi się OK, wskazując, że nukleofekcja się powiodła. Dodaj 0,5 do 1 mililitra zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium firmy Dulbecco do kubka nukleofekcji, aby zatrzymać reakcję.

Po delikatnym wymieszaniu przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowej tubki.

12:58

Transfekcja komórek RAW264.7 z genem reporterowym lucyferazy

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:45

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

13:27

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

04:55

Dostarczanie biomolekuł fluorescencyjnej do komórek bakteryjnych za pomocą elektroporacji

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

03:59

Dostarczanie genów in vitro za pośrednictwem elektroporacji: technika impulsów elektrycznych do wprowadzania fluorescencyjnych plazmidów kodujących białko reporterowe do hodowanych komórek

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:52

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:25

Edycja genu CRISPR/Cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

08:51

Hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

06:02

Metoda elektroporacji do dostarczania in vivo plazmidowego DNA w kresomózgowiu dorosłego danio pręgowanego

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

08:26

Nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

Ostatnia aktualizacja: 1 sierpnia 2026