JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:23 min • July 8th, 2025
Aby dostarczyć plazmidy do jąder sporozoitów przez nukleofekcję, należy rozpocząć od zawieszenia izolowanych, żywotnych sporozoitów - ruchliwego, zakaźnego stadium pasożytów - w buforze. Sporozoity to smukłe komórki otoczone zewnętrzną błoną plazmatyczną i leżącym pod nią kompleksem błony wewnętrznej, składającym się z szeregu spłaszczonych pęcherzyków i białek krytycznych dla stabilności strukturalnej i ruchliwości.
Odwirować zawiesinę w celu granulacji sporozoitów. Zawiesić osad sporozoitu w odpowiedniej objętości buforu transfekcji jądrowej, uzupełnionego plazmidami kodującymi białka fluorescencyjne. Bufor transfekcji jądrowej o wysokiej pojemności buforowej i sile jonowej zapewnia wydajną transfekcję przy zachowaniu funkcjonalności sporozoitu.
Przenieść zawiesinę do kuwety transfekcji jądrowej. Umieść kuwetę w uchwycie urządzenia do nukleofekcji. Uruchom odpowiedni program nukleofekcji.
Podczas nukleofekcji, specjalnie zastosowanej, krótkie impulsy wysokiego napięcia, wraz ze składnikami buforowymi, tymczasowo przerywają błonę plazmatyczną i kompleks błony wewnętrznej, tworząc pory transbłonowe, które zapewniają plazmidom dostęp do cytoplazmy.
Jednocześnie te pola elektryczne o wysokim natężeniu zakłócają również dwuwarstwową błonę jądrową otaczającą jądro, która tworzy przejściowe przerwy, ułatwiając bezpośrednie wejście plazmidów do jądra, bez potrzeby podziału komórki.
Po zakończeniu nukleofekcji pory błony komórkowej i jądrowej ponownie się uszczelniają, przywracając integralność błony i homeostazę, jednocześnie zatrzymując plazmidy wewnątrz jądra.
Wyjmij kuwetę z urządzenia. Dodaj odpowiednie podłoże do odzyskiwania sporozoitu i przenieś do świeżej probówki. Z powodzeniem nukleofektowane sporozoity plazmidowym DNA wykazują ekspresję białek fluorescencyjnych.
Najpierw odwirować zawiesinę sporozoitów lub merozoitów o stężeniu 600 x g przez 10 minut, a następnie odrzucić supernatant. W następującej kolejności dodaj 85 mikrolitrów buforu do transfekcji jądrowej, 10 mikrogramów plazmidu i 25 jednostek enzymu restrykcyjnego do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej sporozoity lub merozoity. Przenieść zawiesinę do kubka do transfekcji jądrowej.
Umieść kubek w rowku transferu jądra, włącz urządzenie do nukleofekcji za pomocą przycisku zasilania i wybierz procedurę transfekcji U-033. Po zakończeniu programu naciśnij przycisk X urządzenia do nukleofekcji, a na ekranie pojawi się OK, wskazując, że nukleofekcja się powiodła. Dodaj 0,5 do 1 mililitra zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium firmy Dulbecco do kubka nukleofekcji, aby zatrzymać reakcję.
Po delikatnym wymieszaniu przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowej tubki.