JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:31 min. • July 8th, 2025
Wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych to technika przenoszenia transgenu do systemu gospodarza.
Aby wyprodukować myszy transgeniczne, zacznij od izolowanych jaj zapłodnionych myszami w odpowiednim pożywce hodowlanej. Umieść zapłodnioną miskę hodowlaną zawierającą jaja na stoliku mikroskopowym, wstępnie zainstalowanym z aparatem laserowym i podłączonym do oprogramowania sterującego. Obserwuj przy odpowiednim powiększeniu.
Zapłodnione jaja są otoczone osłonką przejrzystą, ochronną warstwą glikoproteiny, która barieruje cząsteczki lentiwirusa. Aby przeniknąć przez tę barierę, włącz aparat laserowy i upewnij się, że dioda LED lasera jest widoczna ponad osłoną przejrzystą. Za pomocą oprogramowania sterującego odpal laser. Dostosuj czas wypalania do żądanej średnicy perforacji.
Umieść jaja w inkubatorze w celu wyzdrowienia. Po krótkiej inkubacji usuń jaja i dodaj cząsteczki lentiwirusa zawierające interesujący nas gen i fluorescencyjny marker selekcyjny.
Przy perforacji osłonki przejrzystej lentiwirus łatwo dyfunduje w kierunku błony komórki jajowej i wnika przez endocytozę. Lentiwirus rozpada się, uwalniając swoje RNA, które po sekwencyjnym przetworzeniu na dwuniciowy DNA dostaje się do jądra gospodarza, integrując obce geny z genomem gospodarza.
Wysiaduj jaja i pozwól im rozwinąć się w blastocysty. Wszczepij blastocysty krytym samicom myszy. Po zakończeniu ciąży odzyskaj młode i przeanalizuj je pod kątem obecności transgenu.
Gdy jaja znajdują się w inkubatorze, ustaw i skalibruj laser XYClone zgodnie z zaleceniami producenta. Gdy jaja będą gotowe, umieść pierwszą płytkę kroplową na stoliku mikroskopu laserowego i ręcznie ustaw ostrość osłonki przejrzystej. Po upewnieniu się, że światło LED lasera jest widoczne przez obiektyw, przesuń stolik mikroskopu, aby wycelować w strefę za pomocą lasera LED i użyj oprogramowania komputerowego, aby ustawić laser XYClone na 250 mikrosekund.
Dostosuj rozmiar światła LED do odpowiednich wymiarów i trzykrotnie przebij osłonę przezroczystą każdego jajka za pomocą lasera, aby uzyskać trzy otwory o średnicy 10 mikrometrów.
Bardzo ważne jest, aby wykonać perforację szybko, ale ostrożnie, ponieważ zapłodnione jaja nie mogą przebywać poza inkubatorem dłużej niż 15 minut.
Następnie włóż perforowane jaja z powrotem do inkubatora na kolejne dwie godziny. Pod koniec drugiej inkubacji potraktuj kroplę KSOM o pojemności 50 mikrolitrów 2 mikrolitrami skoncentrowanego lentiwirusa bez mieszania i włóż jaja z powrotem do inkubatora na cztery dni. Kiedy jaja rozwiną się w blastocysty, użyj niechirurgicznego urządzenia do transferu zarodków, aby zdeponować około 10 do 15 zarodków w i około 2 mikrolitrach KSOM.
17 dni po transferze zarodków pozwól ciężarnej myszy urodzić naturalnie lub w razie potrzeby pobierz noworodki przez cesarskie cięcie.