JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:33 min. • July 8th, 2025
Zacznij od optymalnej ilości złotych kulek - biologicznie obojętnych i nietoksycznych nośników genów - w probówce do mikrowirówki. Następnie dodaj środki kationowe - spermidynę i chlorek wapnia, a następnie pożądane fragmenty DNA do złotych koralików. Delikatnie przesuń probówkę i rozpocznij inkubację.
Chlorek wapnia wiąże się z fragmentami DNA i ułatwia ich powlekanie złotymi kulkami za pomocą reszt spermidyny. Następnie odwirować i usunąć rozpuszczalnik. Ponownie zawiesić kulki pokryte DNA w etanolu. Delikatnie odpipetować kulki na sterylnym krążku makronośnikowym. Pozostaw do wyschnięcia.
Ustawić biolistyczny pistolet genowy składający się z rurki rozpędzającej hel i komory bombardowania z płytką bezpieczeństwa i ekranem zatrzymującym w odpowiednich miejscach. Następnie odwróć krążek makronośny i załaduj go poniżej płytki bezpieczeństwa.
Następnie umieść docelowe komórki gospodarza hodowane w odpowiednim stałym podłożu uzupełnionym sorbitolem - stabilizatorem osmotycznym w celu poprawy wydajności transformacji. Gdy konfiguracja będzie gotowa, odpal pistolet genowy.
Gdy hel przemieszcza się w dół rury przyspieszającej, ciśnienie nadal rośnie, aż do pęknięcia płytki pęknięcia, tworząc fale uderzeniowe helu. Te fale uderzeniowe napędzają dysk makronośny przenoszący złote koraliki w kierunku ekranu zatrzymującego, który przepuszcza tylko złote koraliki.
Przyspieszone złote kulki wnikają w jądro komórki gospodarza, integrując pożądane DNA z genomem komórki gospodarza.
Zacznij od użycia kleszczy do zanurzenia pomarańczowych krążków biolistycznych makronośnika w 100% etanolu, a następnie przenieś krążki na dużą szalkę Petriego zawierającą suszyt, uważając, aby krążki nie dotykały środka osuszającego. Po wyschnięciu wciśnij krążki w wytarte etanolem srebrne uchwyty na krążki, a następnie rozkręć rurkę ze złotych koralików i podlej 12 mikrolitrów roztworu kulek do jednej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówki na transformację.
Następnie kolejno dodaj 2 mikrogramy DNA, 10 mikrolitrów chlorku wapnia i dwa mikrolitry zasady wolnej od spermidyny do każdej probówki kulek. Wirować każdą próbkę, a następnie inkubować probówki w temperaturze otoczenia przez 5 minut, od czasu do czasu delikatnie przesuwając w celu ponownego zawieszenia osadzonych kulek.
Pod koniec inkubacji osadzać złote kulki pokryte DNA i ostrożnie odsysać supernatant. Powoli ponownie zawieś kulki całkowicie w 600 mikrolitrach 100% etanolu, a następnie ponownie zagnieźdź ogniwa, tym razem ponownie zawieszając kulki w 8 mikrolitrach etanolu.
Teraz dozuj każdą tubkę koralików na środek pojedynczego krążka biolistycznego w kółkach o średnicy 1 centymetra. Jeśli obecne jest wystarczające stężenie koralików, złote kółko będzie widoczne na środku każdego krążka, gdy koraliki wyschną.
Aby uruchomić pistolet genowy, najpierw włącz pompę próżniową, a następnie przekręć pokrętło zbiornika helu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż zostanie osiągnięte ciśnienie około 2200 PSI na manometrze. Następnie przestaw lewy czerwony przełącznik, aby włączyć pistolet genowy i dostosuj natężenie przepływu próżni i odpowietrznika tak, aby próżnia osiągnęła 28 cali rtęci w ciągu 15 sekund. Upewnij się, że odległość między płytką bezpieczeństwa a makronośnikiem wynosi również w tym momencie około 3/8 cala.
Gdy wszystko jest na swoim miejscu, przetrzyj całą komorę 70% etanolem i zanurz płytki bezpieczeństwa w 100% etanolu. Po wysuszeniu krążków na sterylnej powierzchni użyj klucza dynamometrycznego, aby poluzować uchwyt płytki bezpieczeństwa i włóż czystą tarczę. Przykręć uchwyt płytki bezpieczeństwa z powrotem na miejsce i obróć go raz w prawo za pomocą klucza dynamometrycznego, aby go dokręcić.
Następnie zanurz sita siatkowe w 100% etanolu. Po wyschnięciu umieść sitko na białej plastikowej płycie montażowej i umieść uchwyt dysku macrocarrier, stroną DNA do dołu, w komorze dysku. Przykręć srebrną nasadkę i umieść płytkę montażową w najwyższym gnieździe, a następnie umieść płytkę agarową YPD zawierającą 1 molowy sorbitol na dolnej płycie.
Teraz zamknij drzwi komory i zablokuj je na miejscu, a następnie naciśnij i przytrzymaj środkowy czerwony przełącznik w pozycji górnej, aby włączyć próżnię i umożliwić jej osiągnięcie 28 cali słupa rtęci. Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu podciśnienia i przesunięciu środkowego przełącznika w dolną pozycję, przytrzymaj prawy czerwony przełącznik, aby odpalić.
Gdy płytka bezpieczeństwa pęknie, natychmiast zwolnij przycisk ognia i przesuń środkowy czerwony przełącznik do środkowego położenia, aby odpowietrzyć komorę do 0 PSI. Jeśli strzał się powiódł, na blaszce będzie widoczny złoty pierścionek. Oczyść płytkę bezpieczeństwa i resztki dysku makronośnika i wyłącz pistolet genowy, a następnie przekręć pokrętło zbiornika helu zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby wyłączyć gaz i wyłączyć pompę próżniową.