JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:02 min • July 8th, 2025
Aby przetoczyć komórki gospodarza za pomocą RNA zawierającego wektory retrowirusowe, weź probówkę zawierającą upakowane wektory w odpowiednich pożywkach. Każdy wektor zawiera kapsyd wirusa, zawierający dopełniacz RNA transgenu, który ma zostać zintegrowany z genomem gospodarza i ważnymi enzymami wirusowymi. Kapsyd otoczony jest dwuwarstwą lipidową, która ułatwia wejście do komórki gospodarza.
Dodać wektory w obecności odpowiedniego odczynnika do transfekcji do studzienki płytki hodowlanej zawierającej zawiesinę komórek gospodarza. Przykryj talerz. Wirować z niską prędkością, aby umożliwić transdukcję wirowania. W ten sposób wektor wirusowy zbliża się do powierzchni komórki gospodarza, zwiększając wydajność transdukcji.
Jednocześnie polikationy w odczynniku do transfekcji neutralizują ujemne ładunki wirusa i komórki gospodarza, sprzyjając adsorpcji wirusa na komórkach docelowych.
W związku z tym receptory na powierzchni wirusa ułatwiają jego fuzję z błoną gospodarza. Kapsyd wirusa dostaje się do komórki i pęka, uwalniając transgeniczne RNA i enzymy wirusowe do jej cytoplazmy.
Wewnątrz cytoplazmy wirusowa odwrotna transkryptaza przekształca RNA w jednoniciowy komplementarny DNA, a następnie zmienia go w dwuniciowy prowirusowy DNA. Powstałe w ten sposób DNA dostaje się do jądra. Enzym integrazy wirusowej pośredniczy w integracji prowirusowego DNA z genomem gospodarza, w wyniku czego powstają transdukowane komórki.
Zebrać świeży supernatant wirusa z linii komórkowej producenta wirusa. W tym momencie komórki powinny być dobrze rozmieszczone o określonej morfologii. Następnie ostrożnie odessać górne 2 mililitry pożywki z każdej studzienki 6-dołkowej płytki zawierającej komórki szpiku kostnego. Unikaj zasysania komórek szpiku kostnego, które zwykle są skoncentrowane w środku studzienki.
Dodać 3 mililitry świeżo uzupełnionego supernatantu wirusowego do każdej studzienki 6-dołkowej płytki zawierającej komórki szpiku kostnego. Po owinięciu płytek folią należy powtórzyć transdukcję wirową, a następnie umieścić rozpakowane płytki w inkubatorze do hodowli tkankowych. Po 24 godzinach trzeciego dnia usuń i wymień 2 mililitry pożywki ze studzienek.