JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:44 min • July 8th, 2025
Stłuszczenie wątroby jest stanem patologicznym charakteryzującym się nadmiernym gromadzeniem się tłuszczów w hepatocytach - wybitnym typie komórek wątroby. Tłuszcze odkładają się w postaci kropelek lipidów o różnej wielkości w cytoplazmie hepatocytów.
Strukturalnie kropelka lipidowa zawiera rdzeń z neutralnych, hydrofobowych tłuszczów, takich jak trójglicerydy i estry cholesterolu. Rdzeń otoczony jest monowarstwą fosfolipidową ozdobioną różnymi białkami.
Aby zobrazować odkładanie się tłuszczu, weź wielodołkową płytkę zawierającą przylegającą kulturę hepatocytów. Komórki są wstępnie traktowane pożywką steatogeniczną w celu wywołania gromadzenia się w nich kropelek lipidów.
Dodaj pożądane stężenie paraformaldehydu, który dyfunduje do komórek i sieciuje białka. Ten krok dezaktywuje proteazy i zachowuje strukturę hepatocytów. Odrzucić paraformaldehyd i dodać roztwór Oil-red-O zawierający barwnik organiczny rozpuszczony w izopropanolu.
Izopropanol działa jako rozpuszczalnik nośnikowy dla trudno rozpuszczalnych cząsteczek Oil-red-O. Pomaga to cząsteczkom barwnika dostać się do utrwalonych hepatocytów i ostatecznie dotrzeć do kropelek lipidów. Po wejściu do środka barwnik przenosi się z izopropanolu do obojętnych lipidów ze względu na jego większe powinowactwo, tworząc kompleks barwnikowo-lipidowy. Powoduje to czerwone zabarwienie kropelek lipidów.
Wyrzuć nadmiar barwnika i obserwuj komórki pod mikroskopem. Wewnątrzkomórkowe kropelki lipidów są intensywnie czerwone.
Umieść szkiełko nakrywkowe z hodowli komórkowej w każdym dołku na 24-dołkowej płytce i zasiew komórki HepG2, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Po odpowiedniej inkubacji przemyć komórki 1 mililitrem PBS i wyrzucić supernatant. Utrwal je 1 mililitrem 4% paraformaldehydu w PBS i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wyrzuć nadmiar paraformaldehydu i spłucz komórki 1 mililitrem wody destylowanej.
Następnie dodaj 1 mililitr 70% izopropanolu i inkubuj przez 5 minut. Wyrzuć nadmiar izopropanolu i dodaj 1 mililitr roztworu O z czerwienią olejową i inkubuj przez 30 minut. Wylej nadmiar roztworu Oil-red O, a następnie spłucz 1 mililitrem wody destylowanej. Obserwuj komórki pod mikroskopem w powiększeniu 400x.