JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:10 min. • July 8th, 2025
Komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) są głównymi składnikami komórkowymi osłonki środkowej - środkowej warstwy ściany naczynia krwionośnego. W odpowiedzi na patologiczne sygnały lub starzenie się komórki te pośredniczą w zwapnieniu naczyń krwionośnych - zjawisku akumulacji wapnia w macierzy zewnątrzkomórkowej.
Weź płytkę wielodołkową zawierającą przylegającą warstwę wstępnie zwapniałej, mysiej hodowli VSMC aorty. Inkubuj komórki z roztworem formaliny, aby usieciować białka komórkowe i ustabilizować strukturę VSMC przed barwieniem.
Rozpocznij barwienie von Kossa, odsysając formalinę ze studzienki i dodając roztwór azotanu srebra. Inkubować płytkę pod odpowiednim źródłem światła.
Gdy roztwór azotanu srebra dotrze do miejsc zwapnienia w macierzy zewnątrzkomórkowej warstwy VSMC, jony srebra zastępują jony wapnia związane z fosforanem. Powoduje to przejściowe żółte zabarwienie. W obecności materii organicznej i światła fotochemiczna degradacja fosforanu srebra powoduje tworzenie się metalicznego srebra w kolorze czarnym.
Wyrzuć maksymalną ilość zużytego roztworu azotanu srebra. Potraktuj komórki roztworem tiosiarczanu sodu. Roztwór ten przekształca resztkowe sole srebra w rozpuszczalny w wodzie kompleks, który można usunąć poprzez końcowe spłukanie wodą, poprawiając kontrast barwienia.
Wyobraź sobie poplamione komórki, aby zlokalizować nierozpuszczalne czarne osady wskazujące na zwapnienie.
Aby wywołać zwapnienie w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych, przenieś komórki do sześciodołkowej płytki hodowlanej i pozwól im przylegać. Następnie ponownie nakarm komórki w pożywce do zwapnienia. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej siedem dni. Następnie odessać pożywkę z płytki do hodowli komórkowej. Umyj komórki raz w wodzie dejonizowanej.
Napraw komórki, umieszczając je w 1 mililitrze 10% formaliny w temperaturze pokojowej na 20 minut. Następnie usuń formalinę i umyj utrwalone komórki wodą destylowaną przez 5 minut.
Następnie inkubuj komórki w 1 mililitrze 5% roztworu azotanu srebra pod żarówką o mocy od 60 do 100 watów przez 1 do 2 godzin. Następnie odessać roztwór azotanu srebra i przemywać wodą destylowaną przez 5 minut. Po 5 minutach usuń nieprzereagowane srebro, umieszczając komórki w 1 mililitrze 5% roztworu tiosiarczanu sodu w wodzie destylowanej na 5 minut. Następnie płucz komórki wodą destylowaną przez 5 minut. Komórki wybarwione metodą von Kossa są teraz gotowe do obrazowania za pomocą standardowej mikroskopii w świetle odwróconym.