Barwienie błękitem metylenowym w celu oceny tworzenia się kolonii przerzutowych in vitro: procedura barwienia w celu oceny przerzutów poprzez ilościowe oznaczanie pobranych komórek rakowych z mysiego modelu raka

Podczas przerzutów nowotworowych komórki nowotworowe z guza pierwotnego przemieszczają się przez układ krążenia, wynaczyniają się do odległych narządów i tworzą guzy wtórne.

Aby ocenić przerzuty do płuc w mysim modelu raka piersi, któremu wstrzyknięto komórki 4T1, wysoce przerzutowe komórki raka piersi, należy przygotować zawiesinę komórkową, w tym komórki 4T1, wyizolowaną z pobranych płuc. Odwirować zawiesinę i ponownie zawiesić komórki w pożywce zawierającej 6-tioguaninę, 6-TG - analog guaniny. Wysiewaj zawiesinę komórkową na płytce hodowlanej.

6TG dostaje się do normalnych komórek, gdzie specyficzny enzym transferazy przekształca go w nukleotyd 6-TG, toksyczny nukleotyd. Te cytotoksyczne nukleotydy włączają się do DNA, powodując uszkodzenie DNA i selektywnie eliminują komórki z hodowli. Komórki 4T1 mają zmniejszoną zdolność do tworzenia toksycznych nukleotydów, co ułatwia ich przetrwanie i przyleganie do płytki. W zależności od zdolności proliferacyjnych komórek tworzą kolonie.

Potraktuj komórki metanolem. Metanol przenika do komórek i denaturuje białka komórkowe. Inkubuj komórki z błękitem metylenowym.

Dodatnio naładowany barwnik dostaje się do komórki, oddziałuje z ujemnie naładowanym DNA, interkalując w przestrzenie między sąsiednimi parami zasad nici DNA. Wiąże się również z RNA w cytoplazmie, ale z mniejszym powinowactwem. Jądra barwią się na ciemnoniebiesko ze względu na wyższe stężenie DNA niż cytoplazma ze względu na niskie stężenie RNA. Kolonie przerzutowe pojawiają się jako niebieskie kropki.

Wyobraź sobie płytę. Użyj oprogramowania do określenia kolonii przerzutowych, określając ilościowo obciążenie przerzutami w płucach myszy.

Doprowadź objętość rurki do 10 mililitrów za pomocą 1X HBSS. Następnie przelej zawartość przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Użyj tłoka 1-mililitrowej strzykawki, aby delikatnie zmielić próbkę przez sitko.

Odwirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 350 razy g i wyrzucić supernatant. Następnie umyj granulkę dwukrotnie 10 mililitrami 1X HBSS. Zawiesić osad w 10 mililitrach 60 mikromolowych kompletnych pożywek hodowlanych 6-tioguaniny i w razie potrzeby umieścić próbki na 10-centymetrowych płytkach do hodowli komórkowych, stosując schemat rozcieńczania.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 5 dni. Nalewać pożywki hodowlane z płytek do odpowiedniego pojemnika na odpady. Aby utrwalić komórki, dodaj 5 mililitrów nierozcieńczonego metanolu do każdej płytki i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że metanol jest zakręcany tak, aby pokrył całą płytkę.

Wlej metanol z talerzy do odpowiedniego pojemnika na odpady, a następnie przepłucz każdą płytkę 5 mililitrami wody destylowanej. Dodaj 5 mililitrów 0,03% błękitu metylenowego na płytkę i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że roztwór błękitu metylenowego jest zawirowany tak, aby pokrył całą płytkę. Wlej błękit metylenowy do odpowiedniego pojemnika na odpady i ponownie przepłucz każdą płytkę 5 mililitrami wody destylowanej.

Odwróć talerz do góry nogami i osusz go ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Umieść talerz na pokrywce i pozostaw do wyschnięcia na noc na powietrzu. Kolonie przerzutowe będą niebieskie. Po wyschnięciu płytki można je przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony.