JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:27 min • July 8th, 2025
W przypadku barwienia chrząstki zacznij od utrwalonego w formalinie, zatopionego w parafinie wycinka chrząstki od myszy poddanej eutanazji.
Najpierw zanurz próbkę w substytucie ksylenu - bezpiecznym środku czyszczącym, który usuwa wosk parafinowy i odsłania odwodnioną tkankę. Następnie potraktuj próbkę zmniejszającymi się stężeniami etanolu, aby ponownie nawodnić tkankę do późniejszego barwienia.
Teraz zabarwić próbkę żelazną hematoksyliną Weigerta - barwnikiem organicznym zawierającym jony żelaza - i krótko inkubować. Cząsteczki hematoksyliny tworzą kompleksy z jonami żelazawymi i wnikają do komórki. Jony żelazawe działają jak zaprawa i ułatwiają wiązanie hematoksyliny z kwasami nukleinowymi, nadając im niebieski kolor.
Następnie potraktuj próbkę szybkim zielonym barwnikiem - barwnikiem przeciwstawnym, który wiąże się z tkanką łączną i nadaje zielony kolor. Następnie potraktuj próbkę roztworem kwasu octowego, aby ustabilizować cząsteczki barwnika. Na koniec wybarwić próbkę safraniną-pomarańczą - barwnikiem kationowym - i inkubować.
Dodatnio naładowane cząsteczki safraniny migrują w kierunku ujemnie naładowanych proteoglikanów w chrząstce i wiążą się z nimi, nadając im czerwony kolor. Następnie zamontuj szkiełko w podłożu żywicznym i zwizualizuj je pod mikroskopem.
Zdrowa chrząstka wydaje się intensywnie czerwona ze względu na bogatą w proteoglikany macierz zewnątrzkomórkową, podczas gdy niezdrowa chrząstka wydaje się mniej czerwona z oznakami uszkodzenia tkanki.
Aby wykonać barwienie Safranin-O, najpierw odparafinowaj szkiełka w oksylenie przez trzy do pięciu minut, powtarzając kąpiel oksylenową dwukrotnie. Następnie uwodnić szkiełka w gradiencie etanolu, kończąc na wodzie destylowanej. Następnie umieść szkiełka w roztworze żelaza Hematoksyliny Weigerta, 0,05% roztworze Fast Green, 1% roztworze kwasu octowego i 0,1% roztworze Safraniny-O. Teraz zamontuj prowadnice za pomocą żywicznego podłoża.