JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:50 min. • July 8th, 2025
Nerwy obwodowe składają się z aksonów otoczonych komórkami Schwanna, które owijają się wokół aksonów wieloma warstwami błon komórkowych bogatych w lipidy, tworząc osłonkę mielinową.
Aby uwidocznić nerwy obwodowe, zacznij od szklanego szkiełka zawierającego stały, osadzony w żywicy, nasączony tetratlenkiem osmu poprzeczny odcinek nerwu obwodowego szczura. Sekcje zatopione w żywicy pomagają utrzymać morfologię tkanek.
Leczenie tetratoksydkiem osmu powoduje odkładanie się metalicznego osmu w warstwie lipidowej osłonki mielinowej w miejscu tkanki.
Odpipetować alkaliczny roztwór błękitu toluidynowego na wycinek tkanki. Wysuszyć szkiełko w odpowiedniej temperaturze. Warunki zasadowe i ciepło ułatwiają przenikanie błękitu toluidynowego przez żywicę do wycinka tkankowego.
Błękit toluidynowy, będący barwnikiem kationowym, wiąże się z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi na DNA, a także interkaluje między parami zasad DNA w jądrach komórek Schwanna. Ponadto barwnik wiąże się z RNA w cytoplazmie, poza osłonką mielinową.
Dodać roztwór montażowy na zabarwiony odcinek nerwowy i przykryć szkiełkiem nakrywkowym, aby przygotować tkankę do obrazowania. Pod mikroskopem świetlnym warstwy osłonki mielinowej wydają się czarne z określonymi zmielinizowanymi strukturami włókien nerwowych po leczeniu osmem, podczas gdy aksony pozostają niezabarwione.
Jądra komórek Schwanna i cytoplazma mają różne odcienie niebieskiego ze względu na metachromatyczne właściwości barwnika, co ułatwia wizualizację morfologii aksonów i stopnia mielinizacji w nerwach obwodowych.
Aby zabarwić odcinki nerwowe, użyj plastikowej pipety lub mikropipety, aby dodać kroplę roztworu błękitu toluidynowego na wierzch odcinków nerwowych. Po 20 do 30 sekundach spłucz nadmiar roztworu błękitu toluidynowego, delikatnie zanurzając szkiełka w słoiku z wodą dejonizowaną, powtarzając 3 do 4 razy, aż skrawki będą czyste.
Suszyć szkiełka przez co najmniej 15 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze pokojowej. Po wyschnięciu dodaj zwykłą pożywkę montażową i przykryj sekcje szkiełkiem nakrywkowym. Na koniec zbadaj zamontowane sekcje pod mikroskopem świetlnym. Soczewka zanurzeniowa z olejkiem 100X jest zalecana do szczegółowych obrazów w celu obliczenia współczynników g.