JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:32 min • July 8th, 2025
W niejednorodnej populacji komórek nowotworowych leczenie lekiem przeciwnowotworowym zabiłoby większość komórek, ale komórki oporne na leki przeżywają, co prowadzi do niepowodzenia terapeutycznego.
Aby określić proporcję komórek opornych na leki, należy zasiać heterogeniczną populację komórek nowotworowych na płytce wielodołkowej. Inkubować, aby ułatwić przyleganie komórek. Dodać rosnące stężenie odpowiedniego roztworu leku przeciwnowotworowego.
Interakcja z cząsteczkami leku powoduje obumieranie wrażliwych komórek, a następnie odklejanie się od płytek hodowlanych. W przeciwieństwie do tego, komórki oporne na leki przeżywają i pozostają przyczepione do płytki.
Odessać zużytą pożywkę, aby usunąć oderwane komórki. Dodać świeżą pożywkę wolną od leków i inkubować płytkę w warunkach fizjologicznych. Komórki oporne na leki namnażają się i tworzą kolonie nowotworowe. Teraz dodaj roztwór barwiący fiolet krystaliczny do kolonii i inkubuj.
Fiołek krystaliczny, fioletowy, przepuszczalny przez błonę, dodatnio naładowany barwnik wnika do komórek i wiąże białka anionowe i DNA, nadając w ten sposób komórkom fioletowy kolor.
Następnie dodaj etanol, aby rozpuścić nieprzereagowaną plamę. Umyj, aby usunąć nadmiar plamy i wysusz płytkę na powietrzu.
Kolonie oporne na leki są wyświetlane jako fioletowe kropki. Policz liczbę kolorowych kolonii w każdej studzience. Przedstaw procent żywotności komórek na wykresie, aby określić odsetek lekoopornych komórek nowotworowych przy każdym stężeniu leku.
W tej procedurze płytka 2000 komórek, używając 2 mililitrów pożywki na dołek, w płytkach 6-dołkowych. Po 24 godzinach dodać rosnące stężenie docetakselu zarówno dla linii komórkowych DU145, jak i 22Rv1. Dodać DMSO tylko do jednego dołka jako kontrolnego o tej samej objętości, co dla najwyższej dawki docetakselu.
Po 72 godzinach odessać pożywkę zawierającą lek i dodać świeżą pożywkę wolną od docetakselu. Inkubuj płytki przez jeden do dwóch tygodni, aż kolonie będą widoczne pod mikroskopem.
Aby zabarwić kolonie, umyj je delikatnie 2 do 3 mililitrami PBS i inkubuj je z dwoma do trzech mililitrami roztworu fioletu krystalicznego przez 20 minut, wewnątrz okapu do hodowli tkankowej lub okapu wyciągowego. Następnie usuń roztwór barwiący i umyj płytki 2 do 3 mililitrami wody. Następnie usuń wodę i wysusz płytki na powietrzu.
Zrób cyfrowe zdjęcia płyt w celu przedstawienia postaci. Przeanalizuj wynik, wizualizując dołki i ręcznie licząc kolonie za pomocą markera.