JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:37 min. • July 8th, 2025
Enocyty larwalne Drosophila to wyspecjalizowane komórki, które przyczepiają się w postaci dyskretnych skupisk na podstawowej powierzchni bocznego naskórka - powierzchownej warstwie skóry. Te enocyty biorą przede wszystkim udział w metabolizmie lipidów.
Podczas głodu enocyty te gromadzą nadmiar kropelek lipidów. Każda kropla składa się z hydrofobowego rdzenia z obojętnych lipidów, takich jak trójglicerydy i estry cholesterolu, otoczonych monowarstwą fosfolipidów.
Aby uwidocznić kropelki lipidów, należy pobrać wypreparowany fragment naskórka larw Drosophila z dołączonymi enocytami. Potraktuj buforem utrwalającym zawierającym paraformaldehyd, aby usieciować białka komórkowe, takie jak proteazy, i zachować integralność strukturalną enocytów. Usuń bufor utrwalający. Inkubuj z fluorescencyjnym barwnikiem na bazie BODIPY w ciemności, aby uniknąć fotowybielania.
Podczas inkubacji niepolarny barwnik dyfunduje przez błonę komórkową enocytów i przenika przez monowarstwę otaczającą kropelki lipidów. Hydrofobowość cząsteczek barwnika umożliwia ich przemieszczanie się do niepolarnego rdzenia kropelek lipidów w celu związania obojętnych lipidów.
Zamontuj próbkę na szkiełku tak, aby enocyty dotykały szkiełka mikroskopowego, aby uzyskać wyraźną wizualizację. Uszczelnić próbkę za pomocą szkiełka nakrywkowego i obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Po wzbudzeniu niebieskim światłem o długości fali czterech dziewięćdziesięciu trzech nanometrów, barwnik emituje zieloną fluorescencję o długości pięciuset trzech nanometrów. Zielone fluorescencyjne plamy potwierdzają obecność kropelek lipidów.
W przypadku barwienia kropelkami lipidów należy inkubować wycięty naskórek w buforze utrwalającym przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze, a następnie szybko zawiesić w 1 mililitrze PBS. Następnie umyj próbki trzema 5-minutowymi płukaniami w 1 mililitrze PBS na pranie, aby usunąć wszelkie pozostałości utrwalacza.
Po ostatnim myciu inkubować próbki naskórka za pomocą odpowiedniej sondy lipofilowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze. Podczas inkubacji należy owinąć probówki z próbkami w folię, aby chronić tkanki przed światłem, i umyć próbki trzy razy w 1 mililitrze PBS przez 10 minut na pranie.
Aby zobrazować enocyty, przenieś każdą próbkę naskórka do 6 mikrolitrów podłoża montażowego na czystym szkiełku mikroskopowym. Dostosuj orientację tkanki tak, aby wewnętrzna powierzchnia zawierająca enocyty stykała się z dolną częścią szkiełka. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na naskórek i uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci. Po wyschnięciu lakieru należy zobrazować próbki pod mikroskopem konfokalnym w 63-krotnym powiększeniu z odpowiednimi długościami fal wzbudzenia i emisji.