JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:40 min. • July 8th, 2025
Podczas niedokrwienia mózgu upośledzony przepływ krwi do mózgu zmniejsza dopływ tlenu i składników odżywczych do tkanki, powodując uszkodzenie mózgu. Po krótkim niedokrwieniu, gdy przepływ krwi do mózgu zostaje przywrócony, reperfuzja ze zwiększonym dopływem tlenu powoduje nadprodukcję reaktywnych form jonów, co prowadzi do oksydacyjnego uszkodzenia tkanki, znanego jako uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne.
Aby ocenić uszkodzenie mózgu po urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym w modelu szczurzym, najpierw zbierz mózg szczura. Wypłucz w schłodzonym buforze, aby usunąć zanieczyszczenia i krew. Przekrój mózg, aby uzyskać plastry koronalne o pożądanej grubości. Ostrożnie przenieś plastry na tacę zawierającą bufor - przednią powierzchnią skierowaną do góry - w celu późniejszego barwienia.
Dodać roztwór ciepłego chlorku trifenylotetrazolu, TTC, rozpuszczalnego w wodzie barwnika redoks, na plasterki mózgu. Inkubuj w ciemnych warunkach, ponieważ TTC jest wrażliwy na światło. TTC wnika do komórek w obrębie wycinka tkanki.
W żywych komórkach aktywny enzym dehydrogenazy miotochondrialnej bursztynianu w obecności kofaktorów redukuje TTC, bezbarwny po utlenieniu, do nierozpuszczalnego w wodzie, czerwonego formazanu, barwiąc żywe komórki na ciemnoczerwono. Jednak komórki martwicze nie mają aktywności dehydrogenazy; w ten sposób TTC pozostaje w postaci utlenionej, barwiąc komórki na biało.
Po inkubacji przenieś wycinki mózgu do tacki do obrazowania. Oddziel półkule w płaszczyźnie strzałkowej. Wyobraź sobie wycinki mózgu.
Zdrowa tkanka wydaje się czerwona, podczas gdy uszkodzona tkanka wydaje się biała, co odróżnia tkankę martwiczą od żywotnej tkanki i umożliwia oszacowanie zakresu uszkodzenia tkanki.
Po usunięciu mózgu, w tym pnia mózgu, z czaszki, umieść mózg brzuszną stroną do góry w macierzy mózgowej. W zależności od wagi zwierząt wybierz odpowiedni rozmiar matrycy mózgu ze stali nierdzewnej. Za pomocą ostrzy ogranicz przednią i ogonową część mózgu. Następnie włóż ostrza częściowo do kanałów między pierwszym a ostatnim ostrzami.
Gdy wszystkie ostrza zostaną włożone i ułożone równolegle, dociśnij wszystkie ostrza dłonią w tym samym czasie, aby pokroić mózg na 2-milimetrowe plasterki koronalne. Następnie chwyć mocno ostrza wzdłuż boków dwoma palcami i wyjmij je razem z pokrojonym mózgiem z matrycy. Ułóż plasterki mózgu jeden po drugim na tacy, upewniając się, że przednia powierzchnia każdego plasterka jest zawsze skierowana do góry.
Następnie wlej ciepły 1% roztwór chlorku trifenylotetrazolu i PBS na wycinki mózgu i inkubuj przez 8 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Po inkubacji przenieś plastry mózgu do niebieskiej plastikowej tacy, aby uchwycić obrazy. Ułóż plastry mózgu w kolejności sekwencyjnej od części czołowej do ogonowej i użyj skalpela, aby oddzielić półkule w płaszczyźnie strzałkowej.