Barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian: technika in vitro do wykrywania hodowanych osteoklastów zawierających enzym TRAP

Osteoklasty to duże, wielojądrzaste komórki w kształcie kopuły znajdujące się na powierzchni kości. Komórki te zawierają liczne ziarnistości cytoplazmatyczne bogate w odporną na winian kwaśną fosfatazę lub TRAP - enzym metaloproteinowy wydzielany z pofałdowanej granicy osteoklastów do tkanki kostnej. Enzym ten trawi macierz zewnątrzkomórkową i rozpuszcza kryształy mineralne, ułatwiając resorpcję kości.

Aby wykryć granulki TRAP jako markery cytochemiczne osteoklastów, należy pobrać szalkę hodowlaną zawierającą przylegające osteoklasty. Dodaj roztwór barwiący TRAP do komórek. Roztwór ten składa się z substratu - pochodnej naftolu zawierającej fosforan i kwasu winowego w buforze uzupełnionym solą diazoniową.

Dodaj kwas octowy do tego roztworu, aby utrzymać kwaśne pH niezbędne do barwienia TRAP. Inkubuj komórki w ciemności w temperaturze fizjologicznej, aby uzyskać optymalną aktywność enzymu TRAP.

Roztwór barwiący dostaje się do osteoklastów, gdzie kwas winowy hamuje aktywność hydrolizującą wrażliwych na winian fosfataz kwasowych w innych komórkach.

W tym samym czasie TRAP hydrolizuje dodany substrat w celu usunięcia jego grupy fosforanowej. Zhydrolizowany substrat łączy się z solą diazoniową z roztworu barwiącego, tworząc bordowy nierozpuszczalny kompleks barwników. Kompleks ten wytrąca się w postaci granulek w miejscach aktywności enzymatycznej.

Wyobraź sobie komórki pod mikroskopem. Osadzanie się bordowych granulek barwnika wewnątrz cytoplazmy potwierdza obecność w kulturze osteoklastów zawierających TRAP.

Na tym etapie należy odessać pożywkę i delikatnie przemyć próbkę trzy razy za pomocą 1X PBS. Następnie utrwal komórki w każdym dołku 96-dołkowej płytki za pomocą 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.

Po utrwaleniu odessać roztwór utrwalający i delikatnie umyć komórki trzykrotnie wodą dejonizowaną, wstępnie podgrzaną do 37 stopni Celsjusza. Następnie odessaj wodę dejonizowaną i dodaj 100 mikrolitrów barwnika TRAP do każdej studzienki 96-dołkowej płytki.

Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut i osłoń ją przed światłem. Po zabarwieniu odessać plamę TRAP i delikatnie zmyć trzykrotnie wodą dejonizowaną. Następnie zobrazuj osteoklasty w odwróconym mikroskopie w 40-krotnym powiększeniu.