Barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian: technika in vitro do wykrywania hodowanych osteoklastów zawierających enzym TRAP

Osteoklasty to duże, wielojądrzaste komórki w kształcie kopuły znajdujące się na powierzchni kości. Komórki te zawierają liczne ziarnistości cytoplazmatyczne bogate w odporną na winian kwaśną fosfatazę lub TRAP - enzym metaloproteinowy wydzielany z pofałdowanej granicy osteoklastów do tkanki kostnej. Enzym ten trawi macierz zewnątrzkomórkową i rozpuszcza kryształy mineralne, ułatwiając resorpcję kości.

Aby wykryć granulki TRAP jako markery cytochemiczne osteoklastów, należy pobrać szalkę hodowlaną zawierającą przylegające osteoklasty. Dodaj roztwór barwiący TRAP do komórek. Roztwór ten składa się z substratu - pochodnej naftolu zawierającej fosforan i kwasu winowego w buforze uzupełnionym solą diazoniową.

Dodaj kwas octowy do tego roztworu, aby utrzymać kwaśne pH niezbędne do barwienia TRAP. Inkubuj komórki w ciemności w temperaturze fizjologicznej, aby uzyskać optymalną aktywność enzymu TRAP.

Roztwór barwiący dostaje się do osteoklastów, gdzie kwas winowy hamuje aktywność hydrolizującą wrażliwych na winian fosfataz kwasowych w innych komórkach.

W tym samym czasie TRAP hydrolizuje dodany substrat w celu usunięcia jego grupy fosforanowej. Zhydrolizowany substrat łączy się z solą dia