JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:52 min. • July 8th, 2025
Testy tworzenia kolonii mierzą zdolność komórek do proliferacji do wzrostu w kolonie.
Po pierwsze, zawiesina komórek pochodzących ze szpiku kostnego nasienna składająca się z erytrocytów i komórek jednojądrzastych, w tym mezenchymalnych komórek macierzystych lub MSC, w pożywce na płytce hodowlanej i inkubacji. MSCs przylegają do dna płytki, podczas gdy erytrocyty i komórki jednojądrzaste pozostają w zawiesinie i są odrzucane.
Dodaj świeże pożywki zawierające czynniki wzrostu, aby wspomóc przeżycie MSC. W zależności od ich indywidualnego potencjału proliferacyjnego, MSCs replikują się, tworząc kolonie.
Następnie potraktuj kolonie metanolem. Metanol przenika do komórek, wypiera wodę ze środowiska wewnątrzkomórkowego i denaturuje białka, zachowując architekturę komórkową.
Inkubuj utrwalone kolonie roztworem barwiącym Giemsa - mieszaniną produktów utleniania błękitu metylenowego, głównie lazuru B, barwnika zasadowego i eozyny Y, barwnika kwaśnego. Po dyfuzji do komórek dodatnio naładowane lazurowe dimery B wiążą się poprzez interkalację z ujemnie naładowanym DNA w jądrze, nadając niebieskie zabarwienie.
Ujemnie naładowane monomery eozyny Y oddziałują następnie z niezneutralizowanymi ładunkami dodatnimi na związanych lazurowych dimerach B, tworząc "kompleks eozyny-Y-lazuru-B", zmieniając zabarwienie zabarwionego na niebiesko DNA na fioletowe.
W cytoplazmie bogatej w rybosomy lazur B wiąże się z ujemnie naładowanym RNA, ale zmniejszona penetracja eozyny Y do rybosomów o dużej gęstości, zapobiega tworzeniu się kompleksu eozyna-Y-lazur-B, barwiąc RNA na niebiesko.
Teraz umyj płytkę buforem, aby usunąć nadmiar plamy i wysuszyć na powietrzu. Policz liczbę kolonii, które pojawiają się jako skupiska komórek z fioletowymi jądrami i niebieską cytoplazmą.
Aby przeprowadzić test CFU, należy przygotować 10 mililitrów roztworu Giemsy na każde naczynie, używając sterylnej wody do rozcieńczenia roztworu podstawowego od 1 do 10. Wyjmij pożywkę z naczynia do hodowli komórkowych i użyj PBS do ostrożnego umycia komórek.
Za pomocą czystego metanolu utrwal komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie wyrzuć metanol i dodaj roztwór Giemsy. Inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Po inkubacji użyj PBS do dwukrotnego przemycia komórek. Następnie wysusz talerz na powietrzu głową do przodu na ręczniku papierowym. Za pomocą markera z tyłu talerza ręcznie policz kolonie.