JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:42 min. • July 8th, 2025
Proteoglikany składają się z białka rdzeniowego kowalencyjnie przyłączonego do siarczanowych łańcuchów glikozaminoglikanów.
Aby uwidocznić proteoglikany, zacznij od rusztowań na bazie kolagenu - porowatego podłoża polimerowego - i umieść na nich zawiesinę mezenchymalnych komórek macierzystych lub MSC. Zapewnia to strukturalne wsparcie dla MSC i pozwala im rosnąć zarówno na powierzchni, jak i wewnątrz wnęk rusztowań.
Traktuj konstrukty w chondrogennej pożywce różnicującej zawierającej transformujące czynniki wzrostu, które napędzają transformację MSCs w dojrzałe chondrocyty - komórki chrzęstne. Dojrzałe chondrocyty wydzielają proteoglikany, które tworzą sieć z kolagenem w rusztowaniu.
Weź wycinek przygotowany z konstruktu obciążonego chondrocytami. Dodać kwaśny roztwór niebieskiej plamy alcian uzupełniony chlorowodorkiem guanidu i inkubować. Podczas inkubacji chlorowodorek guanidyny w roztworze barwnika dysocjuje wszelkie agregaty proteoglikanów w celu lepszego barwienia.
Następnie ujemnie naładowane siarczanowane glikozaminoglikany z proteoglikanów wiążą się z dodatnio naładowanymi cząsteczkami barwnika alcian blue zawierającymi miedź, powodując powstawanie niebieskich osadów.
Następnie zanurz szkiełko w roztworze odbarwiającym zawierającym chlorek magnezu. Jony magnezu konkurują z dodatnio naładowanymi cząsteczkami barwnika o miejsca wiązania na glikozaminoglikanach, zapobiegając w ten sposób nadmiernemu barwieniu.
Zobrazuj sekcję. Niebieskie zabarwienie potwierdza obecność proteoglikanów w próbce
Aby przeprowadzić różnicowanie chondrogenne z wyrobu medycznego w kształcie gąbki utworzonego z liofilizowanego kolagenu typu 1, pokrój w kostkę po 3 milimetry z każdej strony. Wysiewaj MSCs na wierzchu kostek w stężeniu 4 x 106 komórek/ml.
Po pozostawieniu komórek na przyleganie do kostek przez 30 minut w temperaturze pokojowej, utrzymuj konstrukty kolagenu MSC w pożywce chondrogennej, zgodnie z wykazem w protokole tekstowym. Dodaj 0,4% roztworu błękitu alkijskiego do sekcji i inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Następnego dnia użyj 40% DMSO i 0,05 molowego chlorku magnezu, aby umyć komórki przez 30 minut, a następnie użyj szybkiej czerwieni jądrowej, aby przeciwdziałać barwieniu komórek.