JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:03 min • July 8th, 2025
W rdzy kawy zarodniki Hemileia vastatrix - chorobotwórczego grzyba - lądują na powierzchni rośliny i wyrastają z rurki kiełkowej, inicjując w ten sposób infekcję za pośrednictwem strzępek.
Strzępki te rozprzestrzeniają się wewnątrz tkanki i atakują komórki roślinne poprzez wyspecjalizowane struktury przypominające palce zwane haustoriami, które wchłaniają składniki odżywcze roślin. Haustoria wydziela również cząsteczki efektorowe, które są rozpoznawane przez białka odpornościowe rośliny, co prowadzi do bogatego w pektyny enkapsulacji haustorii w celu ograniczenia infekcji.
Aby zobrazować tę interakcję, zacznij od ultracienkiego, zatopionego w żywicy, zainfekowanego odcinka liścia kawy. Teraz potraktuj próbkę laktofenolem cotton blue - barwnikiem histologicznym zawierającym fenol, kwas mlekowy, glicerol i błękit bawełniany. Podgrzej krótko szkiełko.
Gdy składniki barwnika wnikają w tkankę, fenol eliminuje wszelkie żywe organizmy, podczas gdy kwas mlekowy i glicerol pomagają zachować architekturę komórkową. Jednocześnie cząsteczki błękitu bawełnianego wiążą się z ugrupowaniami chityny w ścianie komórkowej grzyba i barwią ją na niebiesko.
Umyć próbkę wodą destylowaną. Następnie potraktuj próbkę czerwonym barwnikiem rutenowym.
Dodatnio naładowane cząsteczki rutenu wiążą się z ujemnie naładowanymi polisacharydami w bogatej w pektyny ścianie komórkowej roślin i barwią ją na czerwono. Ponownie umyj szkiełko i wizualizuj pod mikroskopem.
Bogata w pektyny ściana komórkowa roślin wydaje się czerwona, otaczając niebieską haustorię rozciągającą się od niebieskich strzępek grzybów.
Pokrój blok na odcinki o grubości 5 mikrometrów za pomocą mikrotomu obrotowego wyposażonego w 8-centymetrowe stalowe ostrza. Umieść sekcje na szkiełkach pokrytych wodą destylowaną, a następnie przenieś szkiełka na gorącą płytę do wyschnięcia w temperaturze 40 stopni Celsjusza i promuj przyleganie sekcji do szkiełek.
Po wyschnięciu oznacz szkiełka nazwą odniesienia do bloku i numerem szkiełka. Przykryj sekcje 2 mililitrami 5% błękitu bawełnianego w laktofenolu i podgrzewaj je na gorącej płycie w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Usunąć nadmiar barwnika, myjąc szkiełko trzykrotnie w zlewce wypełnionej wodą destylowaną. Zabarwić go 2 mililitrami 0,01% czerwieni rutenu w wodzie przez jedną minutę.
Usunąć nadmiar barwnika, myjąc szkiełko trzykrotnie w zlewce wypełnionej wodą destylowaną. Umieść kroplę wody destylowanej na skrawki i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym w celu przeprowadzenia analizy mikroskopowej w świetle.