JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:49 min • July 8th, 2025
Zwłóknienie to zwiększone odkładanie się kolagenu fibrylarnego w macierzy zewnątrzkomórkowej uszkodzonej tkanki. Strukturalnie składa się z łańcuchów polipeptydowych kolagenu potrójnej helisy.
Aby zabarwić kolagen czerwonym barwnikiem Picrosirius, weź utrwalony paraformaldehydem, zatopiony w parafinie wycinek tkanki serca. Zanurz wycinek tkanki w ksylenie - rozpuszczalniku organicznym - aby rozpuścić otaczający wosk.
Sekwencyjnie traktować odparafinowaną tkankę zmniejszającymi się stężeniami alkoholu w celu zastąpienia ksylenu. Zanurz tkankę w wodzie, aby ją nawodnić w celu lepszej wizualizacji plam w kolejnych krokach.
Zanurz tkankę w czerwonym roztworze picrosiriusa zawierającym czerwień Sirius - anionowy barwnik azowy - i kwas pikrynowy.
Czerwień Syriusza zawiera kwaśne grupy sulfonowe, które oddziałują z podstawowymi grupami aminowymi lizyny, hydroksylizyny i argininy obecnymi w kolagenie. Kwas pikrynowy pomaga utrzymać kwaśne pH, ułatwiając wiązanie cząsteczek barwnika w orientacji równoległej do kolagenu.
Opłucz szkiełka w zakwaszonym roztworze odbarwiającym, aby usunąć nadmiar plam. Umieść kroplę podłoża mocującego na szkiełku i obejrzyj go pod mikroskopem jasnego pola.
Obszar zwłóknienia zawierający kolagen wydaje się jaskrawoczerwony w porównaniu z niezwłóknieniowymi obszarami o żółtym kolorze.
Po utrwaleniu tkanki serca umieść ją na urządzeniu do cięcia tkanek, pokrój w plastry o grubości 2 milimetrów i umieść skrawki w kasecie do zatapiania.
Po zatopieniu parafiny i dodatkowym podziale zgodnie z protokołem tekstowym, należy odparafinować szkiełka, umieszczając je w zbiorniku z ksylenem na 30 minut. Następnie ponownie nawodnij tkankę w kolejno rozcieńczonej serii alkoholowej, a następnie wody destylowanej.
Następnie użyj odpowiedniego roztworu czerwieni Picrosirius, aby całkowicie pokryć skrawki tkanki i inkubować przez godzinę. Następnie użyj 0,5% roztworu kwasu octowego, aby dwukrotnie przepłukać szkiełka i dwukrotnie przepłukać próbki w alkoholu bezwodnym.
Wysuszyć próbki na powietrzu i umieścić je w żywicy syntetycznej za pomocą szkiełka nakrywkowego. Następnie użyj światła widzialnego pod mikroskopem przy 200-krotnym powiększeniu, aby zobrazować szkiełka.