JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:48 min. • July 8th, 2025
Miażdżyca występuje z powodu gromadzenia się lipoprotein w wewnętrznej wyściółce tętnic, co powoduje gromadzenie się blaszki miażdżycowej, pogrubienie i zwężenie tętnic oraz zmniejszony przepływ krwi.
Blaszki składają się z włóknistej czapeczki z komórkami mięśni gładkich i macierzą zewnątrzkomórkową, otaczającą rdzeń złożony z lipoprotein o niskiej gęstości, LDL - kulistych cząstek z hydrofobowym rdzeniem estrów cholesterolu i trójglicerydów, otoczonych zewnętrzną warstwą fosfolipidową - wraz z komórkami zapalnymi.
Aby uwidocznić bogate w lipidy blaszki miażdżycowe, uzyskaj świeżo pobrany łuk aorty myszy. Przenieś go na ciemną platformę dostosowaną do potrzeb tła, aby poprawić kontrast podczas obrazowania na dużym obszarze. Dodaj bufor, aby zapobiec odwodnieniu tkanek.
Usuń okołonaczyniową tkankę tłuszczową otaczającą łuk aorty, aby zapobiec fałszywemu barwieniu tła. Naciąć aortę i jej gałęzie wzdłużnie przez światło, aby odsłonić najbardziej wewnętrzną powierzchnię z nagromadzoną blaszką miażdżycową.
Przymocuj otwarty łuk aorty do platformy i inkubuj w etanolu. Etanol wypiera wodę z tkanki, dezaktywując białka i zachowując architekturę tkanki.
Potraktuj barwnikiem Sudan IV rozpuszczonym w rozpuszczalnikach organicznych. W obrębie płytki nazębnej Sudan IV, rozpuszczalny w tłuszczach barwnik diazowy o wysokim powinowactwie do trójglicerydów i estrów cholesterolu lipoprotein, przemieszcza się z fazy rozpuszczalnika organicznego i wiąże się z hydrofobowym rdzeniem lipidów LDL, tworząc stabilne kompleksy. Zmyj nadmiar plamy za pomocą etanolu.
Pod mikroskopem stereoskopowym poplamione bogate w lipidy blaszki miażdżycowe wydają się pomarańczowo-czerwone, podczas gdy obszary bez płytki miażdżycowej wydają się blade.
Aby przygotować łoże do przypinania do analizy en face, złóż segment folii z wosku parafinowego 8 razy, aby uzyskać płaską powierzchnię o wymiarach 25 x 25 milimetrów, a następnie owiń czarną taśmę izolacyjną wokół folii, aby uzyskać ciemne tło dla aorty.
Umieść etykietę z tyłu łoża do przypinania i użyj ołówka, aby zapisać numer identyfikacyjny myszy. Przenieś łuk aorty na łóżko przypinające i dodaj kroplę PBS do tkanki. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego oczyść aortę z pozostałej okołoprzybyszowej tkanki tłuszczowej i użyj nożyczek Vannas i kleszczyków Dumonta, aby delikatnie usunąć całą otaczającą tkankę tłuszczową bez manipulowania lub uszkadzania aorty.
Następnie wprowadź nożyczki Vannas do światła aorty, aby odsłonić powierzchnię błony wewnętrznej. Rozpocznij przecinanie zewnętrznej krzywizny łuku wstępującego w kierunku dystalnym, kontynuując rozcinanie gałęzi, w tym tętnicy ramienno-głowowej, i oszczędzając grzbietową część zstępującego obszaru klatki piersiowej.
Aby wyświetlić powierzchnię błony wewnętrznej, rozetnij mniejszą krzywiznę i złóż aortę. Za pomocą mikro uchwytu na igły Castroviejo przymocuj otwarty łuk do łoża szpilkowego końcem drobnych szpilek owadów bez rozciągania próbki, delikatnie odginając szpilki od próbki, gdy tkanka jest utrzymywana na miejscu. Następnie przechowuj przypięty łuk zadrukowany do dołu na szalce Petriego PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
W przypadku barwienia Sudan IV należy płukać próbkę przez 5 minut na szalce Petriego zawierającej 70% etanol z łukiem skierowanym w dół, a następnie przenieść próbkę do naczynia z roztworem roboczym Sudan IV na 7 minut.
Pod koniec inkubacji przepłukać próbkę dwoma 3-minutowymi płukaniami w 80% etanolu w celu odbarwienia normalnej powierzchni błony wewnętrznej, a następnie przeprowadzić końcowe płukanie w PBS, przed powrotem tkanki na oryginalną szalkę Petriego. Następnie uzyskaj mikrofotografie pod mikroskopem stereoskopowym podłączonym do kamery cyfrowej pod 10-krotnym powiększeniem, uzyskując obrazy przypiętego łuku zanurzonego w PBS, używając małych metalowych ciężarków do przytrzymania łoża pinowego do dna szalki Petriego.