JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:59 min. • July 8th, 2025
W celu oddzielenia badanego białka metodą chromatografii anionowej od dializowanego lizatu białka bakteryjnego, należy dodać bufor wiążący, aby zmniejszyć lepkość lizatu i zapobiec jego zatykaniu kolumny chromatograficznej.
Czynniki chelatujące w buforze wiążą kationy dwuwartościowe, hamując aktywność proteazy i zapobiegając degradacji białek. Dodatkowo bufor o pH powyżej punktu izoelektrycznego białka docelowego, pI, pI, pH, przy którym białko nie ma ładunku netto, powoduje, że nadmiar ujemnie naładowanych jonów hydroksylowych neutralizuje dodatnio naładowane grupy aminowe białka, powodując, że powierzchnia białka jest naładowana ujemnie.
Zmontować kolumnę do chromatografii anionowej, zawierającą usieciowaną fazę stacjonarną na bazie agarozy z dodatnio naładowanymi czwartorzędowymi grupami aminowymi. Dodać bufor wiążący, aby przygotować kolumnę do maksymalnej interakcji białek podczas ładowania próbki. Załaduj rozcieńczony lizat bakteryjny.
Ujemnie naładowane białka docelowe wiążą się ściślej z dodatnio naładowanymi grupami w kolumnie niż mniej ujemnie naładowane białka.
Uruchom bufor wiążący, aby usunąć niezwiązane dodatnio naładowane białka z kolumny. Przepuścić bufor elucyjny p
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych