JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:22 min. • July 8th, 2025
Chromatografia oddziaływań hydrofobowych zależnych od wapnia jest techniką oddzielania białek wiążących wapń od innych białek niewiążących wapnia w próbce.
Na początek weź wstępnie zmontowaną kolumnę chromatograficzną zawierającą matrycę usieciowanych kulek agarozy derywatyzowanych hydrofobowymi grupami fenylowymi, aby ułatwić interakcje z białkami docelowymi. Zrównoważyć go buforem wiążącym zawierającym bardzo wysokie stężenie jonów wapnia, aby uzyskać maksymalną interakcję żywicy i białka docelowego podczas późniejszego ładowania próbki.
Pobrać próbkę zawierającą dializowaną mieszaninę białkową i uzupełnić ją takim samym stężeniem chlorku wapnia, jakie jest stosowane w buforze wiążącym do równoważenia kolumny. Maksymalizuje to wiązanie białek z kolumną.
Jony wapnia wiążą się z określonymi białkami w lizacie, wywołując zmianę konformacyjną w tych cząsteczkach białka, odsłaniając ich hydrofobowe regiony.
Przefiltrować mieszaninę, aby oddzielić zanieczyszczenia i agregaty, aby zapobiec ich zatykaniu kolumny. Załadować ten filtrat do kolumny wstępnie zrównoważonej. Białka z odsłoniętymi obszarami hydrofobowymi oddziałują z odpowiednimi hydrofobowymi grupami fenylowymi żywicy.
Przemyć za pomocą buforu wiążącego zawierającego sól w celu usunięcia niezwiązanych białek w celu zwiększenia czystości próbki w późniejszych etapach. Przepuścić przez kolumnę bufor elucyjny wolny od chlorku wapnia zawierający EDTA - dwuwartościowy chelator.
Ponieważ EDTA chelatuje jony wapnia, oddziaływania hydrofobowe między białkiem docelowym a żywicą zostają zakłócone. Białka docelowe stają się ruchome i eluują z kolumny.
Aby kontynuować oczyszczanie białka, po dializie białek dodaj chlorek wapnia do próbki do końcowego stężenia 25 milimolów, co ułatwi wiązanie S100A12 z żywicą w następnym kroku. Następnie przefiltruj próbkę przez filtr o wielkości nalewania 0,45 mikrona.
Zrównoważyć i próbki HIC do 4 stopni Celsjusza. Następnie należy podłączyć kolumnowe HIC-A i B oraz kolumnę do systemu i dostosować parametry.
Rozpocząć metodę równoważenia kolumny z 1 do 2 objętościami kolumny buforu HIC-A i załadować próbkę oraz "niezwiązany blok próbki do płukania", gdy sygnał UV ponownie osiągnie poziom linii podstawowej.
Następnie rozpocznij elucję za pomocą buforu EDTA zawierającego chelator wapnia. Zbierz 2 mililitry frakcji szczytowych podczas elucji.