JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:22 min. • July 8th, 2025
Chromatografia oddziaływań hydrofobowych zależnych od wapnia jest techniką oddzielania białek wiążących wapń od innych białek niewiążących wapnia w próbce.
Na początek weź wstępnie zmontowaną kolumnę chromatograficzną zawierającą matrycę usieciowanych kulek agarozy derywatyzowanych hydrofobowymi grupami fenylowymi, aby ułatwić interakcje z białkami docelowymi. Zrównoważyć go buforem wiążącym zawierającym bardzo wysokie stężenie jonów wapnia, aby uzyskać maksymalną interakcję żywicy i białka docelowego podczas późniejszego ładowania próbki.
Pobrać próbkę zawierającą dializowaną mieszaninę białkową i uzupełnić ją takim samym stężeniem chlorku wapnia, jakie jest stosowane w buforze wiążącym do równoważenia kolumny. Maksymalizuje to wiązanie białek z kolumną.
Jony wapnia wiążą się z określonymi białkami w lizacie, wywołując zmianę konformacyjną w tych cząsteczkach białka, odsłaniając ich hydrofobowe regiony.
Przefiltrować mieszaninę, aby oddzielić zanieczyszczenia i agregaty, aby zapobiec ich zatykaniu kolumny. Załadować ten filtrat do kolumny wstępnie zrównoważonej. Białka z odsłoniętymi obszarami hydrofobowymi oddziałują z odpowiednimi hydrofobowymi grupami fenylowymi żywicy.
Przemyć
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych