Oczyszczanie białek oparte na chromatografii powinowactwa niklu: technika oczyszczania rekombinowanych białek znakowanych polihistydyną z lizatu komórek bakteryjnych

Aby oczyścić rekombinowane białko połączone ze znacznikiem polihistydyny - ciągiem reszt histydyny na jednym końcu - z lizatu komórek bakteryjnych, najpierw należy rozcieńczyć lizat komórkowy, aby zapobiec zatkaniu kolumny podczas przebiegu chromatograficznego.

Zebrać kolumnę powinowactwa zawierającą dwuwartościowe kationy niklu unieruchomione na matrycy kulki agarozowej przy użyciu kwasu nitrylotrioctowego, czynnika chelatującego. Kwas nitrylotrioctowy wiąże kationy niklu poprzez cztery współrzędne kowalencyjne, podczas gdy dwa miejsca na jonie metalu pozostają dostępne do interakcji ze znacznikami polihistydyny w białku będącym przedmiotem zainteresowania.

Zrównoważyć kolumnę odpowiednim buforem, aby zoptymalizować warunki dla efektywnych oddziaływań metal-białko. Załaduj lizat komórkowy do kolumny.

Rekombinowane białka, przenoszące dostępne końcowe reszty histydyny, tworzą wiązania koordynacyjne z kationami niklu ze względu na wysokie powinowactwo jonów metali do imidazolu, łańcucha bocznego histydyny, i wiążą się z macierzą. Duża liczba kolejnych histydyn w rekombinowanym białku wzmacnia jego przywiązanie do macierzy.

Dla porównania, białka pozbawione reszt histydyny nie przylegają do kolumny i eluują w przepływie. Przemyć kolumnę nisko stężonym buforem imidazolowym.

Imidazol konkuruje ze słabo związanymi zanieczyszczeniami białkowymi, które mogły niespecyficznie przylegać do macierzy poprzez reszty histydyny w ich łańcuchu polipeptydowym, wypierając je i ułatwiając elucję. Przemyć kolumnę silnie skoncentrowanym buforem imidazolowym w celu dysocjacji silnie związanych rekombinowanych białek znakowanych histydyną od chelatu jonów niklu, uwalniając je w przepływie.

Zebrać oczyszczoną rekombinowaną frakcję białkową do dalszej analizy.

Rozpocznij ten protokół od indukowalnej nadekspresji białka znakowanego histydyną, jak opisano w protokole tekstowym. Przygotuj 1 mililitr żywicy kwasu niklowo-nitrylooctowego w kolumnie grawitacyjnej, aby oczyścić białko. Dzień przed użyciem należy zrównoważyć kolumnę przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza z 2 mililitrami buforu równoważącego.

Następnego dnia doprowadzić kolumnę z 4 stopni Celsjusza do temperatury pokojowej przed załadowaniem oczyszczonego lizatu i odstawić na około dwie do trzech godzin. Następnie ponownie zawiesić osad w buforze do lizy.

Sonikuj komórki na lodzie przez 10 razy po 10 sekund, robiąc 30-sekundową przerwę między impulsami. Klarować lizat przez odwirowanie przy 3080 x g przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza za pomocą mikrowirówki.

Przygotować oczyszczony lizat z równymi objętościami buforu do lizy, a następnie nanieść przygotowany sklarowany lizat na kolumnę i zebrać przepływ. Ponownie nanieść oczyszczony przepływ lizatu do kolumny i zebrać przepływ wtórny.

Następnie przemyć kolumnę 5 mililitrami buforu płuczącego #1 i zebrać przepływ. Ponownie przemyć kolumnę 5 mililitrami buforu płuczącego #2 i zebrać przepływ. Teraz nałóż 2 mililitry buforu elucyjnego. Zbierz przepływ w dwóch frakcjach po 1 mililitr każda.