Oczyszczanie białek oparte na chromatografii powinowactwa niklu: technika oczyszczania rekombinowanych białek znakowanych polihistydyną z lizatu komórek bakteryjnych
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:54 min. • July 8th, 2025
Aby oczyścić rekombinowane białko połączone ze znacznikiem polihistydyny - ciągiem reszt histydyny na jednym końcu - z lizatu komórek bakteryjnych, najpierw należy rozcieńczyć lizat komórkowy, aby zapobiec zatkaniu kolumny podczas przebiegu chromatograficznego.
Zebrać kolumnę powinowactwa zawierającą dwuwartościowe kationy niklu unieruchomione na matrycy kulki agarozowej przy użyciu kwasu nitrylotrioctowego, czynnika chelatującego. Kwas nitrylotrioctowy wiąże kationy niklu poprzez cztery współrzędne kowalencyjne, podczas gdy dwa miejsca na jonie metalu pozostają dostępne do interakcji ze znacznikami polihistydyny w białku będącym przedmiotem zainteresowania.
Zrównoważyć kolumnę odpowiednim buforem, aby zoptymalizować warunki dla efektywnych oddziaływań metal-białko. Załaduj lizat komórkowy do kolumny.
Rekombinowane białka, przenoszące dostępne końcowe reszty histydyny, tworzą wiązania koordynacyjne z kationami niklu ze względu na wysokie powinowactwo jonów metali do imidazolu, łańcucha bocznego histydyny, i wiążą się z macierzą. Duża liczba kolejnych histydyn w rekombinowanym białku wzmacnia jego przywiązanie do macierzy.
Dla porównania, białka pozbawione reszt histydyny nie przyle
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych