Chromatografia wykluczania wielkości Separacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii: technika oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych na podstawie ich wielkości

W odpowiednich warunkach hodowli bakterie Gram-ujemne uwalniają pęcherzyki błony zewnętrznej przenoszące ładunek (OMV) do supernatantu. Pęcherzyki te są niejednorodnymi, małymi, kulistymi strukturami, które pośredniczą w komunikacji komórkowej.

Aby frakcjonować subpopulacje OMV o różnej wielkości, należy wziąć pustą kolumnę chromatograficzną wykluczającą wielkość z odpowiednim filtrem u podstawy, aby podeprzeć matrycę.

Wypełnij kolumnę żelową matrycą filtracyjną składającą się z chemicznie obojętnych, kulistych kulek o określonej wielkości porów, upewniając się, że rozmiar jest optymalny, aby wykluczyć przedostawanie się dużych OMV. Zrównoważyć kolumnę odpowiednim buforem, aby zapobiec wysychaniu kulek w celu optymalnego oczyszczenia.

Załaduj supernatant kultury bakteryjnej zawierający różnej wielkości subpopulacje OMV, agregatów białkowych i kwasów nukleinowych na wierzch kolumny. Pozwól próbkom płynąć pod wpływem siły grawitacji.

Gdy próbki przechodzą przez kolumnę, większe OMV, które nie mogą dostać się do porów, przemieszczają się przez przestrzenie międzycząsteczkowe między kulkami żelu, aby zostać najpierw wymyte. Tymczasem mniejsze OMV wnikają w pory matrycy, pokonują dłuższą drogę i wymywają się później.

Ze względu na mniejszy rozmiar agregaty białkowe i kwasy nukleinowe wnikają w różne pory w matrycy, co powoduje, że mają najdłuższy czas retencji w kolumnie i eluują jako ostatnie frakcje. Zebrać oddzielne eluaty OMV i przechowywać je do dalszej analizy.

Na początek użyj szklanego pręta, aby wymieszać podstawową butelkę żelowego medium filtracyjnego i wlej objętość wymaganą do napełnienia kolumny plus około 50% nadmiaru do szklanej butelki. Pozwól, aby kulki opadły i zdekantuj nadmiar płynu. Zawiesić kulki w buforze elucyjnym do końcowego roztworu składającego się w około 70% z żelu i 30% buforu, a następnie odgazować roztwór w próżni.

Zamontuj kolumnę na stojaku pierścieniowym w pozycji pionowej i napełnij kolumnę buforem elucyjnym, aby zwilżyć ścianki, przed opróżnieniem bufora, aż pozostanie tylko około 1 centymetra. Następnie ostrożnie odpipetować kulki żelu do kolumny, jednocześnie opróżniając nadmiar buforu, aby zapobiec osiadaniu kulek, aż kolumna zostanie upakowana na wysokość około 2 centymetrów poniżej dna zbiornika kolumny.

Przed załadowaniem próbki należy odgazować bufor elucyjny w próżni. Przemyć kolumnę około dwukrotnością objętości buforu elucyjnego. Gdy bufor dotrze do górnej części warstwy żelu, ostrożnie dodaj 2 mililitry próbki pęcherzyków błony zewnętrznej o stężeniu od 100 do 200 nanomoli na litr na wierzchu warstwy żelu, nie naruszając powierzchni, i pozwól próbce wejść do żelu.

Powoli dodaj bufor elucyjny do kolumny, nie naruszając warstwy żelu, i umieść 50-mililitrową rurkę pod kolumną. Aby zapobiec wysychaniu kolumny, należy jednocześnie dodać bufor elucyjny do górnej części kolumny.

Po zebraniu 20 mililitrów eluatu umieść stojak z 1,5-mililitrowymi probówkami pod kolumną. Zbierz łącznie 96 frakcji o pojemności 1 mililitra w każdej probówce. Podczas pobierania próbek należy w sposób ciągły dodawać bufor elucyjny do kolumny. Aby oczyścić kolumnę, przepuścić przez kolumnę objętość 1 kolumny 0,1 molowego wodorotlenku sodu, a następnie 2 objętości buforu elucyjnego w kolumnie.