Name: Zastosowanie stałego podwiązania tętnicy środkowej mózgu u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj technikę podwiązania tętnicy środkowej mózgu u myszy do badania ogniskowej niedokrwiennej choroby mózgu. Ta metoda pozwala uzyskać powtarzalne objętości zawału i poprawić przeżywalność zwierząt pooperacyjnie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Technika chirurgiczna została pierwotnie opracowana w laboratorium dr. Williama D. Hilla w Medical College of Georgia. Autorzy chcieliby również podziękować dr. Davidowi A. Rempe oraz Landzie Prifti za udostępnienie kamery do dyssekcji. Badania były wspierane przez NIH NS041744, NS051279, F31 NS064700 oraz AHA 30815697D.

Niniejszy protokół został zatwierdzony przez komisję University of Rochester ds. etycznego wykorzystania zwierząt w badaniach (UCAR). Podczas realizacji protokołu należy przestrzegać technik aseptycznych. Wymagane jest stosowanie sterylnych rękawiczek oraz maski.
Wszystkie urządzenia, materiały, odczynniki i narzędzia wykorzystywane podczas protokołu zostały opisane w Tabeli 1.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
<li>Wstrzyknąć myszom podskórnie buprenorfinę (0,05mg/kg) 2 h przed operacją, bezpośrednio po zabiegu, a następnie co 3-5 h w ciągu pierwszych 24 h okresu pooperacyjnego.</li> 
<li>Wszystkie narzędzia chirurgiczne, gazy i aplikatory z bawełnianą końcówką wysterylizować w autoklawie. Narzędzia chirurgiczne przechowywać w 70% etanolu podczas operacji i osuszać na sterylnej gazie bezpośrednio przed użyciem. Obszar roboczy spryskać 70% etanolem.</li>
<li>Zanestezjować mysz mieszaniną gazową 3% izofluranu i 20% tlenu za pomocą waporyzatora anestetycznego. Ilość tlenu dostosować za pomocą przepływomierza. Poziom znieczulenia sprawdzić poprzez uciskanie palca u nogi lub ogona (zwierzę powinno nie reagować). Poziom anestezji podtrzymać za pomocą 2% (v/v) izofluranu.</li>
<li>Nanieść sztuczne łzy do oczu myszy i zachować ostrożność, aby nie uszkodzić oka podczas procedury chirurgicznej. Umieścić mysz na prawym boku w pozycji bocznej.</li>
<li>Wygolić obszar po lewej stronie między lewym okiem a podstawą lewego ucha za pomocą maszynki do strzyżenia zwierząt. Oczyścić ten obszar, naprzemiennie stosując roztwór betadyny i 70% etanolu za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką, delikatnie pocierając skórę. Powtórzyć w razie potrzeby.</li> 
<li>Umieścić mysz na macie grzewczej połączonej z sondą rektalną, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37°C. Sondę rektalną wprowadzić przy użyciu oleju mineralnego.</li>
<li>Ułożyć mysz na prawym boku pod mikroskopem i przymocować taśmą. Wyciąć otwór w gazie i przykryć obszar operacyjny.</li>
</ol>
2. Procedura chirurgiczna i ligacja MCA
<ol>
<li>Za pomocą cienkich prostych nożyczek wykonaj pionowe nacięcie między lewym okiem a nasadą lewego ucha. Użyj zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych, aby utrzymać pole operacyjne otwarte.</li>
<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj poziome nacięcie mięśnia skroniowego, a następnie delikatnie oddziel mięsień skroniowy od czaszki, powoli pociągając go pęsetą.</li>
<li>Trzymając kość żuchwy zakrzywioną pęsetą, wykonaj niewielką kraniotomię podskroniową w miejscu połączenia łuku jarzmowego i kości łuskowatej, używając igły 18G.</li>
<li>Odsłoń MCA, usuwając niewielkie fragmenty czaszki kleszczami kostnymi. Podczas tego procesu łuk jarzmowy i zawartość oczodołu nie powinny zostać uszkodzone. Jeśli dojdzie do nadmiernego wysuszenia tkanek, nanieś sterylny PBS za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką.</li>
<li>Podwiąż dystalną część MCA, używając kauteryzatora do małych naczyń.</li>
<li>Przywróć mięsień skroniowy na miejsce i zamknij miejsce nacięcia chirurgicznymi szwami z nylonu 5-0.</li>
<li>Przerwij znieczulenie i usuń sondę rektalną. Wstrzyknij myszy podskórnie drugą dawkę buprenorfiny (0.05mg/kg). Umieść mysz w klatce utrzymywanej w temperaturze 37°C za pomocą panelu grzewczego.</li>
<li>Przez następne 24 h uważnie monitoruj mysz pod kątem wystąpienia oznak dyskomfortu (zmniejszony apetyt/spożycie wody, przygarbiona postawa, przyspieszony oddech, zjeżona sierść). Wstrzykuj myszy buprenorfinę podskórnie co 3-5 h po operacji, aż do upływu 24h. W tym okresie zapewnij myszy dostęp do żelu regeneracyjnego.</li>
</ol>
3. Barwienie TTC i oznaczenie objętości zawału
<ol>
<li>Dwadzieścia cztery godziny po operacji mysz należy głęboko znieczulić, a następnie przeprowadzić perfuzję transkardialną przy użyciu mini pompy perystaltycznej z umiarkowaną prędkością przepływu, stosując 4% TTC (w/v) w buforze fosforanowym (PBS) przez 15 min, a następnie 4% roztwór paraformaldehydu przez 10 min. Mózg należy wyjąć i pozostawić w 4% roztworze paraformaldehydu na noc.</li>
<li>Mózg należy umieścić w bloku do sekcjonowania. Następnie, używając żyletek, wykonać skrawki mózgu o grubości 1 mm.</li>
<li>Skrawki należy ułożyć obok linijki milimetrowej. Dokumentację fotograficzną skrawków należy wykonać za pomocą aparatu cyfrowego podłączonego do mikroskopu sekcyjnego.</li>
<li>Powierzchnię obszaru udaru oblicza się, odejmując nieznieszkodowany obszar strony ipsilateralnej od całkowitej powierzchni strony kontralateralnej przy użyciu oprogramowania Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Objętość udaru oblicza się poprzez sumowanie powierzchni udaru poszczególnych skrawków 22.</li> 
</ol>
4. Instrukcje używania oprogramowania Image J
<ol>
<li> Otwórz plik obrazu przeznaczony do analizy w oprogramowaniu Image J, korzystając z menu pliku. </li>
<li> Wybierz narzędzie „straight line” (linia prosta) w programie. Narysuj linię prostą pomiędzy dwiema krawędziami na linijce. Kliknij menu „analyze” (analiza) i wybierz „set scale” (ustaw skalę). Wprowadź znaną odległość jako 1, a jednostkę długości jako mm.</li>
<li> Wybierz narzędzie „freehand circle” (okrąg rysowany odręcznie). Narysuj okrąg, aby obrysować przeciwległą półkulę. Kliknij menu „analyze” i wybierz „measure” (pomiar). Pojawi się okno z obliczeniami, wyświetlające pole powierzchni narysowanego okręgu. </li>
<li> Narysuj kolejny okrąg wokół półkuli ipsilateralnej, wykluczając obszar udaru (biały). Zmierz pole powierzchni zgodnie z instrukcją w punkcie 4.3. Nowa wartość zostanie dodana do okna obliczeń. Różnica między pierwszą a drugą wartością reprezentuje pole powierzchni zawału, oznaczone jako A w poniższym wzorze. </li>
<li> Oblicz pole powierzchni udaru w każdym przekroju, powtarzając kroki 4.2-4.4. Oblicz sumę pól powierzchni udaru wyliczonych w każdym przekroju (∑An). Reprezentuje to objętość udaru, przyjmując, że grubość każdego przekroju wynosi 1mm. 
∑An x 1mm (grubość każdego przekroju) = Objętość udaru</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki: 
Zawały uzyskane poprzez trwałe podwiązanie tętnicy środkowej mózgu (MCA) u myszy mają charakter głównie korowy. Możliwe jest jednak uzyskanie zmian podkorowych, jeśli podwiązanie MCA zostanie wykonane proksymalnie względem odgałęzień soczewicowo-prążkowiastych. Objętość zawału po podwiązaniu MCA może wynosić od 10mm³ do 35mm³ 19, 23. Objętości zawałów obliczone na podstawie barwienia TTC w pracy Moyanova i wsp. 19 wynoszą od 10mm³ do 22mm³, podczas gdy objętości zawałów określone na podstawie obrazów MRI w pracy Filiano i wsp. 23 mieszczą się w przedziale od 20mm³ do 35mm³. Możliwą przyczyną tych różnic może być dokładna lokalizacja podwiązania oraz zastosowanie różnych metod pomiaru objętości zawału. 
Na rysunku 1 przedstawiono mózg myszy typu dzikiego C57/BL6 barwiony TTC 24 h po permanentnej ligacji MCA. Obszar udaru ma biały kolor (Rys. 1A, B). Rysunki 1A i B ilustrują miejsce zawału pod różnymi kątami. Rysunek 2 przedstawia plastry mózgu po udarze o grubości 1mm, barwione TTC, od części przedniej do tylnej (Rys. 2A-G). Objętość zawału obliczono 24 h po operacji. Objętość zawału wynosi ˜23mm³.
<img src="/files/ftp_upload/3039/3039fig1.jpg" alt="Sekcja mózgu myszy przedstawiająca porównanie rozmiaru z linijką; badanie biologiczne, analiza anatomiczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Przedstawienie miejsca udaru. A-B, obrazy całego mózgu barwione TTC, 24 h po ligacji MCA. Biały obszar reprezentuje obszar zawału. 
<img src="/files/ftp_upload/3039/3039fig2.jpg" alt="Poprzeczne przekroje mózgu od przedniej do tylnej części; schemat porównania anatomicznego; analiza neuroanatomiczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki. (A&gt;G), barwione TTC przekroje mózgu o grubości 1mm, 24 h po MCAL. Przekroje są ułożone od przedniej do tylnej części. Biały obszar reprezentuje obszar zawału.

<ol><li>Britton, M., Rafols, J., Alousi, S., Dunbar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+middle+cerebral+artery+occlusion+on+central+nervous+system+apoptotic+events+in+normal+and+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Diabesity+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of middle cerebral artery occlusion on central nervous system apoptotic events in normal and diabetic rats.</a> Int J Exp Diabesity Res. 4, 13-20 (2003).</li>
<li>Ciceri, P., Rabuffetti, M., Monopoli, A., Nicosia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+leukotrienes+in+a+model+of+focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Production of leukotrienes in a model of focal cerebral ischaemia in the rat.</a> Br J Pharmacol. 133, 1323-1329 (2001).</li>
<li>Jin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+transplantation+of+human+neural+precursor+cells+improves+outcome+from+focal+cerebral+ischemia+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Delayed transplantation of human neural precursor cells improves outcome from focal cerebral ischemia in aged rats.</a> Aging Cell. 9, 1076-1083 (2010).</li>
<li>McCaig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+GADD34+expression+after+focal+cerebral+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of GADD34 expression after focal cerebral ischaemia.</a> Brain Res. 1034, 51-61 (2005).</li>
<li>Shirotani, T., Shima, K., Chigasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+studies+of+extracellular+metabolites+in+the+striatum+after+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+in+stroke-prone+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">In vivo studies of extracellular metabolites in the striatum after distal middle cerebral artery occlusion in stroke-prone spontaneously hypertensive rats.</a> Stroke. 26, 878-884 (1995).</li>
<li>Wu, Y. P., Tan, C. K., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Fos-like+immunoreactivity+in+the+brain+and+spinal+cord+of+rats+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of Fos-like immunoreactivity in the brain and spinal cord of rats following middle cerebral artery occlusion.</a> Exp Brain Res. 115, 129-136 (1997).</li>
<li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).</li>
<li>Bederson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+middle+cerebral+artery+occlusion%3A+evaluation+of+the+model+and+development+of+a+neurologic+examination%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination.</a> Stroke. 17, 472-476 (1986).</li>
<li>Carswell, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+gender+influences+on+sensitivity+to+focal+cerebral+ischemia+in+the+stroke-prone+spontaneously+hypertensive+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Genetic and gender influences on sensitivity to focal cerebral ischemia in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat.</a> Hypertension. 33, 681-685 (1999).</li>
<li>Mary, V., Wahl, F., Uzan, A., Stutzmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enoxaparin+in+experimental+stroke%3A+neuroprotection+and+therapeutic+window+of+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Enoxaparin in experimental stroke: neuroprotection and therapeutic window of opportunity.</a> Stroke. 32, 993-999 (2001).</li>
<li>Menzies, S. A., Hoff, J. T., Betz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%3A+a+neurological+and+pathological+evaluation+of+a+reproducible+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Middle cerebral artery occlusion in rats: a neurological and pathological evaluation of a reproducible model.</a> Neurosurgery. 31, 100-107 (1992).</li>
<li>Iaci, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+growth+factor+2+promotes+functional+recovery+with+treatment+initiated+up+to+7+days+after+permanent+focal+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Glial growth factor 2 promotes functional recovery with treatment initiated up to 7 days after permanent focal ischemic stroke.</a> Neuropharmacology. 59, 640-649 (2010).</li>
<li>Richard, M. J. P., Khan, B. V. C. B. J., Saleh, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+by+which+lipoic+acid+confers+protection+during+the+early+stages+of+cerebral+ischemia%3A+A+possible+role+for+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms by which lipoic acid confers protection during the early stages of cerebral ischemia: A possible role for calcium.</a> Neuroscience Research. , (2011).</li>
<li>Heiss, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+derangement+of+periinfarct+viable+tissue+in+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Progressive derangement of periinfarct viable tissue in ischemic stroke.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 12, 193-203 (1992).</li>
<li>Nedergaard, M., Gjedde, A., Diemer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+ischemia+of+the+rat+brain%3A+autoradiographic+determination+of+cerebral+glucose+utilization%2C+glucose+content%2C+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Focal ischemia of the rat brain: autoradiographic determination of cerebral glucose utilization, glucose content, and blood flow.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 6, 414-424 (1986).</li>
<li>Nowicki, J. P., Assumel-Lurdin, C., Duverger, D., MacKenzie, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+evolution+of+regional+energy+metabolism+following+focal+cerebral+ischemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Temporal evolution of regional energy metabolism following focal cerebral ischemia in the rat.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 8, 462-473 (1988).</li>
<li>Butcher, S. P., Bullock, R., Graham, D. I., McCulloch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+amino+acid+release+and+neuropathologic+outcome+in+rat+brain+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Correlation between amino acid release and neuropathologic outcome in rat brain following middle cerebral artery occlusion.</a> Stroke. 21, 1727-1733 (1990).</li>
<li>Arlicot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+remote+microglial+activation+in+rodent+models+of+focal+ischaemia+using+the+TSPO+radioligand+CLINDE%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of remote microglial activation in rodent models of focal ischaemia using the TSPO radioligand CLINDE.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, 2371-2380 (2010).</li>
<li>Moyanova, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+for+type+4+metabotropic+glutamate+receptors+against+ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Protective role for type 4 metabotropic glutamate receptors against ischemic brain damage.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2010).</li>
<li>Ortolano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+of+new+targets+for+pharmacological+intervention+in+stroke%3A+real-time+tracking+of+T-cells+in+the+ischaemic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging of new targets for pharmacological intervention in stroke: real-time tracking of T-cells in the ischaemic brain.</a> Br J Pharmacol. 159, 808-811 (2010).</li>
<li>O'Neill, M. J., A, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal cerebral ischemia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 9.6.1-9.6.32 (2000).</li>
<li>Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+brain+edema+on+infarct+volume+in+a+focal+cerebral+ischemia+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats.</a> Stroke. 24, 117-121 (1993).</li>
<li>Filiano, A. J., Tucholski, J., Dolan, P. J., Colak, G., Johnson, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase+2+protects+against+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase 2 protects against ischemic stroke.</a> Neurobiol Dis. 39, 334-343 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Metoda trwałego podwiązania tętnicy środkowej mózgu (MCA) zapewnia wysoką powtarzalność objętości zawałów oraz zwiększone wskaźniki przeżywalności pooperacyjnej w porównaniu z innymi dostępnymi metodami. Prostota i krótki czas trwania procedury (˜30 min) czynią ją jeszcze bardziej praktyczną. Metoda ta jest szeroko stosowana zarówno u myszy, jak i u szczurów.
Technika ta wymaga inwazyjnego zabiegu chirurgicznego pod stereomikroskopem. Dlatego niezbędne jest doświadczenie w operowaniu pod mikro...

zastosowanie trwałego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej u myszy

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Ogniskowe niedokrwienie mózgu należy do najczęstszych typów udaru występujących u pacjentów. Ze względu na znaczenie kliniczne podjęto długotrwałe wysiłki w celu opracowania odpowiednich modeli zwierzęcych do badania zjawisk rozwijających się podczas niedokrwienia. Techniki te obejmują modele niedokrwienia przejściowego lub trwałego, ogniskowego lub globalnego, z wykorzystaniem wielu różnych gatunków zwierząt, z których najczęściej stosowane są gryzonie.
Metoda trwałego podwiązania tętnicy środkowej mózgu (MCA), określana w literaturze również jako pMCAo, jest powszechnie stosowana jako model niedokrwienia ogniskowego u gryzoni 1-6. Metoda ta została pierwotnie opisana dla szczurów przez Tamurę i współpracowników w 1981 roku 7. W tym protokole w celu uzyskania dostępu do MCA wykonano kraniotomię, a obszary proksymalne zamknięto za pomocą elektrokoagulacji. Obszary zawału obejmują głównie korę mózgową, a niekiedy również prążkowie, w zależności od miejsca zamknięcia naczynia. Technika ta jest obecnie dobrze ugruntowana i stosowana w wielu laboratoriach 8-13. Wczesne zastosowanie tej metody doprowadziło do zdefiniowania i opisania „rdzenia zawału” (infarct core) oraz „penumbry” 14-16, a obecnie często służy ona do oceny potencjalnych związków neuroprotekcyjnych 10, 12, 13, 17. Chociaż wstępne badania przeprowadzono na szczurach, trwałe podwiązanie MCA stosuje się z sukcesem również u myszy po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji 18-20.
Model ten pozwala na uzyskanie powtarzalnych ognisk zawału oraz zwiększa wskaźniki przeżywalności. Około 80% udarów niedokrwiennych u ludzi występuje w obszarze MCA 21, co czyni go bardzo istotnym modelem w badaniach nad udarem. Obecnie dostępna jest niewielka liczba skutecznych metod leczenia pacjentów po udarze, w związku z czym istnieje zapotrzebowanie na dopracowane modele do testowania potencjalnych związków farmakologicznych i oceny wyników fizjologicznych. Metoda ta może być również wykorzystywana do badania wewnątrzkomórkowych mechanizmów odpowiedzi na hipoksję in vivo.
W niniejszym materiale przedstawiamy zabieg ligacji tętnicy środkowej mózgu (MCA) u myszy C57/BL6. Opisujemy przygotowanie przedoperacyjne, zabieg ligacji MCA oraz barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazoliem (TTC) w celu ilościowego określenia objętości zawałów.

Podwiązanie tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest techniką służącą do badania ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. W tej metodzie tętnica środkowa mózgu zostaje odsłonięta poprzez kraniotomię, a następnie podwiązana za pomocą kauteryzacji. Metoda ta zapewnia wysoką powtarzalność objętości zawału oraz zwiększoną przeżywalność pooperacyjną w porównaniu z innymi dostępnymi metodami.

Zastosowanie trwałego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej u myszy

Ogniskowe niedokrwienie mózgu należy do najczęstszych rodzajów udarów występujących u pacjentów. Ze względu na znaczenie kliniczne podejmowano długotrwałe wysiłki w celu...

Ogólnym celem tej procedury jest badanie ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. Realizuje się to poprzez wykonanie najpierw niewielkiego nacięcia skóry pomiędzy lewym okiem a nasadą ucha. Następnie, w miejscu połączenia łuku jarzmowego z kością łuską, wykonuje się kraniotomię w celu odsłonięcia tętnicy środkowej mózgu, która następnie zostaje podwiązana przy użyciu kauteryzatora naczyń krwionośnych.Na koniec skórę zszywa się, aby zamknąć ranę. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące obszar zawału zlokalizowany w lewej półkuli mózgu myszy. Mózg można zabarwić TTC lub poddać badaniu MRI w celu wizualizacji udaru.Mózg po udarze może być również wykorzystany do oznaczenia ekspresji białek lub mRNA. Cześć, nazywam się Garza Chola. Jestem studentem studiów doktoranckich w laboratorium Gale Johnson na Uniwersytecie w Rochester.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie udarów, takie jak zilustrowanie mechanizmów prowadzących do śmierci komórek w niedokrwionym mózgu. Aby przygotować się do operacji, należy wysterylizować wszystkie instrumenty chirurgiczne, gazy i aplikatory poznawcze w autoklawie. Narzędzia chirurgiczne należy przechowywać w 70% ethanol podczas operacji i osuszać na sterylnej gazie bezpośrednio przed użyciem.Na dwie godziny przed operacją spryskaj obszar roboczy 70% ethanol. Wstrzyknij myszy buprenorfinę w dawce 0,05 mg/kg. Lek zostanie podany ponownie natychmiast po operacji, a następnie co trzy do pięciu godzin w ciągu pierwszych 24 godzin okresu pooperacyjnego.Użyj parownika anestetycznego, aby znieczulić mysz mieszaniną 3% izofluranu i 20% tlenu. Dostosuj ilość tlenu za pomocą przepływomierza. Sprawdź poziom znieczulenia poprzez uciśnięcie palca stopy lub ogona.Utrzymaj poziom znieczulenia za pomocą 2% izofluranu. Do oczu myszy zastosuj sztuczne łzy, zachowując ostrożność, aby nie uszkodzić oka podczas procedury chirurgicznej.Umyj mysz na prawym boku w pozycji bocznej, używając trymera do zwierząt. Wygol obszar po lewej stronie między lewym okiem a nasadą lewego ucha. Oczyść ten obszar, naprzemiennie stosując roztwór Betadiny i 70% ethanol, przecierając go delikatnie za pomocą patyczków higienicznych.Konieczne jest powtórzenie procedury. Umieść mysz na podkładce grzewczej połączonej z sondą rektalną. Aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C, wprowadź sondę rektalną, używając oleju mineralnego. Ułóż mysz na prawym boku pod mikroskopem i zabezpiecz taśmą.Wytnij otwór w gazie chirurgicznej i osłoń obszar operacyjny za pomocą precyzyjnych nożyczek prostych. Wykonaj nacięcie pionowe między lewym okiem a podstawą lewego ucha. Użyj zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych, aby utrzymać dostęp do pola operacyjnego w przypadku nadmiernego wysychania tkanek podczas zabiegu.Za pomocą aplikatorów z bawełnianym końcem nanieś sterylny PBS. Używając nożyczek sprężynowych, wykonaj poziome nacięcie mięśnia skroniowego, a następnie powoli odciągnij go pęsetą, aby lekko oddzielić mięsień skroniowego od czaszki. Przytrzymaj kość żuchwy zakrzywioną pęsetą i za pomocą igły 18G wykonaj niewielką subtemporalną kraniotomię w miejscu połączenia łuku jarzmowego z łuską kości skroniowej.Za pomocą wiertarki kostnej usuwa się niewielkie fragmenty czaszki, aby odsłonić MCA. Podczas tego procesu nie należy uszkodzić łuku jarzmowego ani zawartości oczodołu. Używając małego kauteryzatora naczyń, podwiązuje się dystalną część MCA, umieszcza mięsień skroniowy z powrotem w pierwotnej pozycji i stosuje szwy nylonowe 5-0.Aby zamknąć miejsce nacięcia, przerwać znieczulenie i usunąć sondę odbytniczą. Podać myszy podskórnie drugą dawkę buprenorfiny. Przenieść mysz z powrotem do klatki, która była utrzymywana w temperaturze 37 °C.Z zastosowaniem panelu grzewczego. Przez następne 24 godziny należy uważnie monitorować mysz pod kątem wszelkich oznak dyskomfortu, w tym spadku apetytu lub zmniejszonego spożycia wody, zgarbionej postawy, przyspieszonego oddechu lub zjeżonej sierści. Bezpośrednio po zabiegu należy podać myszy żel regeneracyjny.Odczekać od dwóch do trzech godzin po operacji. Następnie wstrzyknąć myszy buprenorfinę podskórnie co trzy do pięciu godzin przez maksymalnie 24 godziny. 24 godziny po operacji głęboko znieczulić mysz i przeprowadzić perfuzję 4%TTC.Usuń mózg i umieść go w 4% roztworze paraformaldehydu na całą noc. Następnego dnia umieść mózg w bloku do sekcjowania. Użyj żyletek, aby pokroić mózg w plastry o grubości 1 mm.Umieść plastry obok linijki milimetrowej. Używając aparatu cyfrowego podłączonego do mikroskopu stereoskopowego, wykonaj zdjęcia plastrów w oprogramowaniu ImageJ.Kliknij menu plik i otwórz wybrany plik zdjęcia. Kliknij kartę linii prostych w programie. Narysuj linię prostą pomiędzy dwoma marginesami na linijce.Kliknij menu Analyze i wybierz opcję Set Scale. Ustaw znaną odległość jako 1, a jednostkę długości jako milimetr. Kliknij kartę Freehand Circle.Narysuj okrąg, aby obrysować przeciwległą półkulę. Kliknij menu analyze i wybierz measure. Pojawi się okno obliczeń wyświetlające pole powierzchni narysowanego okręgu.Narysuj kolejny okrąg wokół półkuli ipsilateralnej, z wyłączeniem obszaru białego obrysu. Zmierz powierzchnię w sposób opisany wcześniej. Nowa wartość zostanie dodana do okna obliczeń.Różnica między pierwszą a drugą wartością reprezentuje obszar zawału. Oblicz powierzchnię udaru w każdym przekroju, powtarzając powyższe kroki dla grubości przekroju wynoszącej 1 mm. Oblicz objętość udaru poprzez zsumowanie powierzchni udaru obliczonej dla każdego przekroju.Rysunek ten przedstawia barwienie TTC mózgu 24 godziny po trwałej ligacji tętnicy środkowej mózgu (MCA) u myszy linii C 57 BL six typu dzikiego. Obszar udaru ma biały kolor i jest widoczny przy różnych powiększeniach i pod różnymi kątami. Przedstawione tutaj plastry o grubości jednego milimetra z mózgu z udarem barwionego TTC pokazują obszar zawału od strony przedniej do tylnej.Objętość obliczono 24 godziny po operacji. Objętość obszaru zawału wynosi około 23 milimetrów sześciennych. Technikę tę można wykonać w 30 minut, jeśli zostanie ona przeprowadzona prawidłowo.Dziękujemy za oglądanie.

the-application-permanent-middle-cerebral-artery-ligation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zastosowanie trwałego zwiększenia środkowego tętnika mózgu u myszy

Włóknista okluzja tętnicy środkowej mózgu jest powszechnie stosowanym modelem badania udaru niedokrwiennego u myszy.

Modelowanie udaru u myszy – zator tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem modelu filamentowego

W materiale wideo demonstrujemy metodę wywołania zatoru w środkowej tętnicy mózgowej u dorosłych myszy z wykorzystaniem wewnątrzluminalnego monofilamentu. Pokazujemy również, jak oceniać zakres zawału mózgu za pomocą barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC).

Myszy model udaru niedokrwiennego wywołanego zamknięciem tętnicy środkowej mózgu

W niniejszej pracy przedstawiono model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu u myszy. Zakres zawału mózgu oceniano za pomocą skali neurologicznej oraz barwienia fioletem krezylowym, który stanowi alternatywę dla barwienia TTC, oferując znaczącą zaletę w postaci możliwości równoległego badania wielu interesujących markerów.

Model mysi wewnątrzluminalnego MCAO: ocena zawału mózgu za pomocą barwienia fioletem krezylu

Opisujemy wysoce powtarzalną metodę trwałego zamknięcia głównego naczynia krwionośnego mózgu gryzoni.  Technikę tę można osiągnąć przy bardzo niewielkim uszkodzeniu obwodowym, minimalnej utracie krwi, wysokim wskaźniku długoterminowego przeżycia i stałej objętości zawału współmiernej do populacji klinicznej ludzi.

Stała niedrożność naczynia mózgowego poprzez podwójne podwiązanie i przecięcie

Różne mysie modele zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) są szeroko stosowane w eksperymentalnych badaniach mózgu. W tym miejscu demonstrujemy model przezczaszkowego stałego dystalnego MCAO, który powoduje konsekwentny zawał kory mózgowej o wielkości odpowiadającej uszkodzeniom spowodowanym przez większość udarów niedokrwiennych u ludzi.

Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Charakterystyka komórek szpikowych mózgu po udarze może być przeprowadzona za pomocą metody frakcjonowania optycznego lub za pomocą analizy cytometrycznej zawiesin leukocytów mózgu. Obie są użytecznymi technikami do przeprowadzenia dokładnego fenotypowego rozróżnienia głównych podzbiorów komórek szpikowych znajdujących się w niedokrwionym mózgu.

Charakterystyka stereologiczna i cytometrii przepływowej subpopulacji leukocytów w modelach przejściowego lub trwałego niedokrwienia mózgu

Aby zrozumieć patofizjologię udaru, ważne jest korzystanie z wiarygodnych modeli. W artykule opisano jeden z najczęściej stosowanych modeli udaru u myszy, określany jako model niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAo) (określany również jako model włókna śródświetlnego lub szewu) z reperfuzją.

Podejście chirurgiczne do niedrożności tętnicy środkowej mózgu i udaru wywołanego reperfuzją u myszy

Chirurgiczne zamknięcie dystalnej gałęzi środkowej tętnicy mózgowej (MCAo) jest często używanym modelem w eksperymentalnych badaniach nad udarem. Manuskrypt ten opisuje podstawową technikę stałego MCAo, połączoną z wstawieniem bocznego okna czaszki, które daje możliwość podłużnej mikroskopii przyżyciowej u myszy.

Przygotowanie bocznego przewlekłego okna czaszki umożliwia obserwację in vivo po niedrożności dystalnej tętnicy środkowej mózgu u myszy

Ten protokół demonstruje unikalny model udaru myszy ze średniej wielkości zawałem i doskonałym wskaźnikiem przeżycia. Model ten pozwala przedklinicznym badaczom zajmującym się udarem mózgu wydłużyć czas trwania niedokrwienia, wykorzystać starzejące się myszy i ocenić długoterminowe wyniki funkcjonalne.

Zmodyfikowany przezczaszkowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu do badania wyników udaru u starszych myszy

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia modelu dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) poprzez przezczaszkową elektrokoagulację u myszy C57BL/6J i oceny późniejszego zachowania neurologicznego i cech histopatologicznych.

Indukcja ostrego udaru niedokrwiennego u myszy przy użyciu techniki niedrożności dystalnej tętnicy środkowej

Celem niniejszej pracy było ustalenie reprodukowalnej metody wykonywania kraniektomii z późniejszym trwałym, selektywnym zamknięciem tętnicy mózgowej środkowej u szczurów dla zastosowania w badaniach eksperymentalnych nad deficytami ruchowymi i przestrzenną pamięcią.

Selektywne i trwałe zatorowanie środkowej tętnicy mózgowej u szczurów: eksperymentalne podejście do badania niedoborów motorycznych i przestrzennej pamięci

Poznaj technikę podwiązania tętnicy środkowej mózgu u myszy do badania ogniskowej niedokrwiennej choroby mózgu. Ta metoda pozwala uzyskać powtarzalne objętości zawału i poprawić przeżywalność zwierząt pooperacyjnie.

Zastosowanie trwałego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej u myszy

Przeglądaj więcej filmów