Zastosowanie permanentnego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej u myszy
25 lipca 2011
Podwiązanie tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest techniką służącą do badania ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. W tej metodzie tętnica środkowa mózgu zostaje odsłonięta poprzez kraniotomię, a następnie podwiązana poprzez kauteryzację. Metoda ta zapewnia wysoką powtarzalność objętości zawałów oraz zwiększoną przeżywalność pooperacyjną w porównaniu z innymi dostępnymi metodami.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. Realizuje się to poprzez wykonanie niewielkiego nacięcia skóry pomiędzy lewym okiem a nasadą ucha. Następnie, w miejscu połączenia łuku jarzmowego z kością łuskową, wykonuje się kraniotomię w celu odsłonięcia tętnicy środkowej mózgu, którą następnie podwiązuje się przy użyciu kauteryzatora do małych naczyń.
Na koniec skórę zszywa się, aby zamknąć ranę. W rezultacie można uzyskać obraz wykazujący obszar zawału zlokalizowany w lewej półkuli mózgu myszy. Mózg można zabarwić TTC lub poddać badaniu MRI w celu wizualizacji udaru.
Mózg po udarze może być również wykorzystywany do oznaczania ekspresji białek lub mRNA. Cześć, jestem Garza Chola. Jestem studentką studiów doktoranckich w laboratorium Gale Johnson na Uniwersytecie w Rochester.
Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie udarów, takie jak zilustrowanie mechanizmów prowadzących do śmierci komórek w niedokrwienym mózgu. Aby przygotować się do operacji, wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, gazy i aplikatory poznawcze w autoklawie. Podczas operacji przechowuj narzędzia chirurgiczne w 70% ethanolu i osuszaj je na sterylnej gazie bezpośrednio przed użyciem.
Spryskaj obszar roboczy 70% etanolem na dwie godziny przed operacją. Wstrzyknij myszy 0,05 mg/kg buprenorfiny. Lek zostanie podany ponownie bezpośrednio po operacji, a następnie co trzy do pięciu godzin w ciągu pierwszych 24 godzin okresu pooperacyjnego.
Użyj parownika do anestezji, aby podać myszy mieszankę gazową składającą się z 3% ISO fluorine i 20% tlenu. Ilość tlenu dostosuj za pomocą przepływomierza. Poziom znieczulenia sprawdź poprzez uciśnięcie palca lub ogona.
Utrzymuj poziom znieczulenia za pomocą 2% isofluranu. Do oczu myszy podawaj sztuczne łzy, zachowując ostrożność, aby nie uszkodzić oka podczas procedury chirurgicznej.
Umyj mysz i ułóż ją na prawym boku w pozycji bocznej, używając trymiera do zwierząt. Wygoń obszar po lewej stronie, pomiędzy lewym okiem a podstawą lewego ucha. Oczyść ten obszar, naprzemiennie stosując roztwór Betadinu i 70%eth etanolu za pomocą aplikatorów z patyczkami bawełnianymi, delikatnie pocierając skórę.
Konieczne jest powtórzenie procedury. Umieść mysz na podkładce grzewczej połączonej z sondą rektalną. Aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C, wprowadź sondę rektalną, używając oleju mineralnego. Ustaw mysz na prawym boku pod mikroskopem i przymocuj za pomocą taśmy.
Wytnij otwór w gazie chirurgicznej i osłoń obszar operacyjny za pomocą cienkich nożyczek prostych. Wykonaj nacięcie pionowe pomiędzy lewym okiem a nasadą lewego ucha. W przypadku nadmiernego wysychania tkanek podczas operacji użyj zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych, aby utrzymać pole operacyjne otwarte.
Użyj aplikatorów z bawełnianymi końcówkami, aby nanieść sterylną sól PBS. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj poziome nacięcie na mięśniu skroniowym, a następnie powoli odciągnij go pęsetą, aby lekko oddzielić mięsień skroniowy od czaszki. Przytrzymaj kość żuchwy zakrzywioną pęsetą i za pomocą igły o rozmiarze 18 G wykonaj małą podskroniową kraniotomię w miejscu połączenia łuku jarzmowego z częścią łuskowatą kości ciemieniowej.
Za pomocą wiertarki kostnej usuwa się niewielkie fragmenty czaszki, aby odsłonić MCA. Podczas tego procesu nie należy uszkodzić łuku jarzmowego ani zawartości oczodołu. Używając małego koagulatora do naczyń, należy podwiązać dystalną część MCA, przywrócić mięsień skroniowy na jego pierwotne miejsce i użyć szwów nylonowych 5-0.
Aby zamknąć miejsce nacięcia, należy przerwać znieczulenie i usunąć sondę odbytniczą. Wstrzyknąć myszy podskórnie drugą dawkę buprenorfiny. Przenieść mysz z powrotem do klatki, która była utrzymywana w temperaturze 37 °C.
Z zastosowaniem panelu grzewczego. Przez następne 24 godziny należy uważnie monitorować mysz pod kątem wystąpienia jakiegokolwiek dyskomfortu, w tym zmniejszenia apetytu lub spożycia wody, przygarbionej postawy, zwiększonej częstości oddychania lub zjeżonej sierści. Bezpośrednio po zabiegu należy podać myszy żel regeneracyjny.
Odczekać od dwóch do trzech godzin po operacji. Następnie wstrzykiwać myszy buprenorfinę podskórnie co trzy do pięciu godzin przez maksymalnie 24 godziny. 24 godziny po operacji poddać mysz głębokiej anestezji i przeprowadzić perfuzję 4%TTC.
Wyjąć mózg i umieścić go w 4% roztworze paraformaldehydu na noc. Następnego dnia umieścić mózg w bloku do sekcjonowania. Za pomocą żyletki pokroić mózg na plastry o grubości jednego milimetra.
Umieść plastry obok linijki z podziałką milimetrową. Używając kamery cyfrowej podłączonej do mikroskopu stereoskopowego, wykonaj zdjęcia plastrów w oprogramowaniu ImageJ.
Kliknij menu plik i otwórz wybrane zdjęcie. Kliknij zakładkę linii prostej w programie. Narysuj linię prostą pomiędzy dwiema krawędziami na linijce.
Kliknij menu Analyze i wybierz opcję Set Scale. Ustaw znaną odległość na 1 i jednostkę długości na milimetr. Kliknij kartę Freehand Circle.
Narysuj okrąg, aby obrysować przeciwległą półkulę. Kliknij w menu analyze (analiza) i wybierz measure (pomiar). Pojawi się okno obliczeń, w którym wyświetli się pole powierzchni narysowanego okręgu.
Narysuj kolejny okrąg wokół półkuli ipsilateralnej, pomijając obszar białego obrysu. Zmierz pole powierzchni w sposób opisany wcześniej. Nowa wartość zostanie dodana do okna obliczeń.
Różnica między pierwszą a drugą wartością reprezentuje pole powierzchni zawału. Oblicz pole powierzchni udaru w każdym przekroju, powtarzając powyższe kroki dla grubości przekroju wynoszącej 1 mm. Oblicz objętość udaru, sumując pola powierzchni udaru obliczone dla każdego przekroju.
Rycina przedstawia barwienie TTC mózgu 24 godziny po permanentnej ligacji tętnicy środkowej mózgu (MCA) u myszy szczepu C 57 BL six typu dzikiego. Obszar udaru ma biały kolor i jest widoczny przy różnych powiększeniach i pod różnymi kątami. Przedstawiono tutaj plastry o grubości 1 mm z barwionego TTC mózgu z udarem, od przedniej do tylnej części obszaru zawału.
Objętość obliczono 24 godziny po operacji. Objętość obszaru zawału wynosi w przybliżeniu 23 mm³. Technika ta może zostać wykonana w 30 minut, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo.
Dziękujemy za oglądanie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Technika podwiązania tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest wykorzystywana do badania ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. Metoda ta polega na odsłonięciu i podwiązaniu tętnicy środkowej mózgu, co pozwala na uzyskanie powtarzalnych objętości zawału oraz poprawę wskaźnika przeżywalności po operacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania nad udarem mózgu
- Modele zwierzęce
Wprowadzenie
- Ogniskowe niedokrwienie mózgu jest kluczowym obszarem badań w zrozumieniu udaru.
- Metoda podwiązania tętnicy środkowej mózgu (MCA) umożliwia prowadzenie kontrolowanych eksperymentów.
- Modele zwierzęce pozwalają na poznanie mechanizmów udaru u ludzi.
- Poprawa wskaźników przeżywalności zwiększa wiarygodność wyników.
Cel badania
- Zbadanie skutków ogniskowego niedokrwienia mózgu.
- Ocena objętości obszarów zawału w kontrolowanych warunkach.
- Pogłębienie zrozumienia patologii udaru.
Zastosowane metody
- Nacięcie wykonano pomiędzy lewym okiem a podstawą ucha.
- Kraniotomię przeprowadzono na wysokości łuku jarzmowego i kości łuskowej.
- Tętnicę mózgową środkową podwiązano przy użyciu kauteryzatora do małych naczyń.
- Po zakończeniu procedury ranę zamknięto poprzez zaszycie skóry.
Główne wyniki
- Zawał zlokalizowany w lewej półkuli mózgu myszy.
- Wizualizacja udaru uzyskana poprzez barwienie TTC lub MRI.
- Wyniki wykazują skuteczność techniki ligacji MCA.
- Odnotowano wysoką powtarzalność objętości zawałów.
Wnioski
- Ligacja tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest niezawodną metodą badania ogniskowego niedokrwienia mózgu.
- Wyższe wskaźniki przeżywalności wpływają na wiarygodność wyników.
- Technika ta może być wykorzystana do dalszych badań nad terapiami udarów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model permanentnego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej zapewnia powtarzalny system badania ogniskowego niedokrwienia mózgu, umożliwiając mechanistyczną ocenę ryzyka związanego z neuroprotekcyjnymi związkami w przedklinicznych badaniach nad udarem. Poprzez generowanie spójnych objętości zawałów u myszy, metoda ta wspiera walidację celów oraz rozwój testów dla kandydatów na leki adresujących niezaspokojone potrzeby w leczeniu udaru niedokrwiennego. Jej istotność w kontekście patologii ludzkiej — gdzie około 80% udarów występuje w obszarze MCA — zwiększa pewność translacyjną i usprawnia selekcję projektów w fazie wczesnego odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w szlakach niedokrwiennych poprzez kontrolowaną indukcję niedokrwienia ogniskowego.
- Wartość naukowa: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie roli celu w tworzeniu rdzenia zawału i penumbry.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną kwantyfikację zawału za pomocą barwienia TTC, co ułatwia spójną ocenę oddziaływania na cel.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do przesiewania związków poprzez ustanowienie modelu niedokrwienia istotnego w kontekście choroby.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar obszaru zawału za pomocą wolumetrii opartej na TTC, umożliwiając ilościową analizę zależności dawka-odpowiedź.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność analizy dzięki przeżywalności na poziomie ~80%, co redukuje zmienność wyników farmakologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje patologię udaru u ludzi z wysoką istotnością anatomiczną i patofizjologiczną w odniesieniu do zawałów w obszarze tętnicy środkowej mózgu (MCA).
- Wartość naukowa: Umożliwia ocenę mechanizmów odpowiedzi na hipoksję wewnątrzkomórkową in vivo, wspierając odkrywanie biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki zestandaryzowanym protokołom chirurgicznym i barwieniu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje proces odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, zapewniając platformę do ograniczania ryzyka mechanistycznego w badaniach nad terapiami udaru.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących celów neuroprotekcyjnych poprzez umożliwienie kontrolowanego niedokrwienia oraz ilościowego określenia obszaru zawału.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu barwieniu TTC, generując ilościowe wyniki objętości zawału do oceny związków.
- Analityka: Generuje pomiary objętościowe (np. zawał ~23 mm³ po 24h), które umożliwiają porównanie między różnymi warunkami i określenie wielkości efektu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki lokalizacji zawału odzwierciedlającej wzorce udaru u ludzi, co wspomaga rozwój badań z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do oceny wielu związków w różnych projektach ze względu na powtarzalność i standaryzowane punkty końcowe.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach niedokrwiennych.
- Wartość operacyjna: zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym procedurom kraniotomii, ligacji oraz barwienia TTC.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wiarygodnych danych o obszarze zawału, co zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach programów badań nad udarem.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację kandydatów na leki neuroprotekcyjne z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o spójne sygnały skuteczności przedklinicznej.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii gryzoni oraz neuroanatomicznej identyfikacji MCA.
- Zależne od instrumentarium mikrochirurgicznego, w tym koagulatorów naczyń, podgrzewaczy oraz precyzyjnych narzędzi do szycia.
- Wymaga standaryzacji protokołów znieczulenia, analgezji oraz monitorowania pooperacyjnego pomiędzy zespołami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania technik przy przejściu z modeli szczurzych na mysie, w tym w zakresie rozmiaru szwu i precyzji okluzji.
- Ograniczone koniecznością zastosowania punktów końcowych w celu przeprowadzenia ilościowej oceny zawału za pomocą barwienia TTC lub MRI.
