Multianalitowy test immunobealikowy: Technika testu immunologicznego oparta na przepływie do jednoczesnego wykrywania wielu podtypów przeciwciał w próbce ludzkiej surowicy

Test immunokulek wieloanalitowych wykorzystuje wiele mikrosfer pokrytych antygenem do jednoczesnego rozpoznawania odpowiadających im przeciwciał docelowych.

Aby rozpocząć ten test, należy pobrać mieszaninę mikrogranulek do probówki zawierającej odpowiedni bufor. Każdy koralik jest pokryty określonym antygenem na swojej powierzchni, co pozwala na łatwe odróżnienie koralików od siebie.

Odpipetować powlekaną mieszaninę immunokulek do dołków płytki do mikromiareczkowania. Uzupełnij studzienki próbką surowicy zawierającą różne izotypy docelowych przeciwciał. Warianty te mają subtelne różnice w swojej strukturze, dzięki czemu każda studzienka może mieć wiele przeciwciał pierwotnych.

Inkubować, aby umożliwić próbce izotypów przeciwciał przyłączenie się do określonych antygenów wychwyconych na odpowiednich kulkach odpornościowych. Przemyć buforem testowym w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał pierwszorzędowych. Dodaj do dołka przeciwciała drugorzędowe oznaczone barwnikiem fluorescencyjnym, odpowiadające każdemu wariantowi przeciwciała pierwszorzędowego.

Każde znakowane przeciwciało drugorzędowe wiąże się z miejscem Fc odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego. Wiele kompleksów przeciwciał pierwotnych antygenu wychwyconych przez kulki jest znakowanych fluorescencyjnie. Umyć płytkę w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych.

Odczytaj płytkę za pomocą analizatora fluorescencyjnego zdolnego do jednoczesnego wykrywania różnych fluoroforów na ich odpowiednich długościach fal. W zależności od wykrycia sygnału można ocenić różne izotypy przeciwciał w surowicy i ich wiązanie z różnymi antygenami.

Aby uzyskać wydajność testu, ponownie zawiesić sprzężone mikrosfery za pomocą wiru na 30 sekund i sonikować przez 60 do 90 sekund. Następnie usuń wymaganą ilość każdego koloidu kulek z odpowiedniej probówki i połącz koloidy kulek w nowej 1,5-milimetrowej probówce do mikrowirówki.

Następnie włóż rurkę do separatora magnetycznego i pozostaw na 60 sekund. Trzymając rurkę nadal w separatorze magnetycznym, usuń supernatant, nie naruszając osadu kulki.

Po wyjęciu kulek z separatora ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach buforu testowego. Wiruj przez 30 sekund przed umieszczeniem rurki w separatorze magnetycznym na 60 sekund, aby oddzielić kulki. Powtórz pranie dwukrotnie.

Następnie należy dostosować stężenie mieszaniny mikrosfer roboczych z trzema pleksami, dodając odpowiednią objętość buforu testowego, aby uzyskać końcowe stężenie 100 mikrosfer na 1 μl dla każdego celu.

Podaniec 25 mikrolitrów mieszaniny mikrosfer do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Rozcieńczyć próbki osocza lub surowicy 500-krotnie w buforze do oznaczania i przygotować próbki wzorcowe zgodnie z pożądanym miareczkowaniem.

Dodać 25 mikrolitrów buforu do oznaczania jako próbkę ślepą i dodać każdą z rozcieńczonych próbek lub wzorca do każdego wyznaczonego dołka 96-dołkowej płytki do pobierania próbek. Po zakończeniu przykryj płytkę aluminiową uszczelką lub folią, aby inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce do płytek ustawionej na 700 obrotów na minutę.

Przygotować roztwór przeciwciał wykrywających przeciwciała anty-ludzkie lub roztwory przeciwciał drugorzędowych w stężeniu 4 μg/ml z buforem do oznaczania, jak opisano w manuskrypcie. Umieść płytkę na separatorze magnetycznym, aby szybko ją umyć, a następnie mocno odwróć płytkę nad pojemnikiem na zagrożenie biologiczne, aby usunąć płyn ze studzienek. Trzymając talerz nadal odwrócony, mocno uderz nim o gruby zwitek papieru.

Następnie umyj każdą studzienkę 100 mikrolitrami buforu do oznaczania i usuń płyn przez siłową inwersję nad pojemnikiem na zagrożenie biologiczne. Powtórz pranie dwa razy. Po ostatnim praniu wyrzuć wszystkie zużyte zwitki papieru do pojemnika na zagrożenie biologiczne.

Następnie dodaj 25 mikrolitrów wtórnego roztworu roboczego przeciwciała do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i przykryj płytkę folią aluminiową, aby inkubować na wytrząsarce płytkowej z prędkością 700 obrotów na minutę.

Po 30 minutach inkubacji przemyć studzienki płytki dwukrotnie buforem do oznaczania, jak pokazano wcześniej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu testowego do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj przez pięć minut na wytrząsarce do płytek w temperaturze pokojowej.

Przeanalizuj próbkę o pojemności 60 mikrolitrów za pomocą analizatora przyrządu zgodnie z instrukcją systemu.