JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:16 min. • July 8th, 2025
Fosfolipidy to złożone lipidy zawierające grupy fosforanowe. Cząsteczki te są hydrolizowane przez enzym zwany fosfolipazą.
Aby wykonać test aktywności fosfolipazy, weź emulsję z żółtka jaja bogatą w fosfolipidy, które działają jako substrat dla enzymu. Żółtko dodajemy do ciepłego roztworu agarozy zawierającego chlorek sodu, który zwiększa stabilność białek żółtka podczas kolejnych etapów.
Uzupełnij mieszaninę chlorkiem wapnia i barwnikiem fluorescencyjnym - rodaminą. Wlej mieszaninę na szalkę Petriego. Po zestaleniu fosfolipidy żółtka pozostają jednorodnie rozmieszczone w matrycy żelu agarozowego.
Za pomocą rurki utwórz w żelu odpowiednio oddalone studzienki. Dodać do studzienek surowe ekstrakty białkowe zawierające fosfolipazę o różnych stężeniach. Inkubować płytkę w temperaturze fizjologicznej.
Fosfolipaza z ekstraktu dyfunduje promieniście do żelu. Jony wapnia w żelu wiążą się z fosfolipazą, aktywując enzymy. Enzym ten rozszczepia fosfolipidy, wytwarzając wolne kwasy tłuszczowe. Cząsteczki rodaminy w żelu tworzą kompleks z uwolnionymi kwasami tłuszczowymi.
Po oświetleniu światłem ultrafioletowym obserwuj pojawienie się fluorescencyjnych halo wokół studni. Halo potwierdza obecność aktywności enzymu. Przy wyższych stężeniach fosfolipazy cząsteczki enzymu dyfundują dalej, zwiększając średnicę halo.
Umyj jedno jajo kurze z 1% SDS w wodzie destylowanej i oddziel żółtko od białka jaja w sterylnych warunkach.
Przygotuj roztwory A, B, C i D. Dodaj 500 mikrolitrów roztworów A i C do roztworu B i 100 mikrolitrów roztworu D. Wymieszaj je i wlej 25 mililitrów do każdej szalki Petriego. Poczekaj, aż roztwór zestali się w sterylnych warunkach i zrób dołki o średnicy około 2 do 3 milimetrów za pomocą cienkiej rurki.
Dodać w sumie 20 mikrolitrów buforu fosforanowego jako kontrolę ujemną w jednym studzience i 20 mikrolitrów oznaczonej fosfolipazy jako kontrolę pozytywną w innym studzience.
Umieść różne ilości surowego białka ekstraktu - 5, 15, 25, 35 i 45 mikrogramów w pozostałych studzienkach, każdy w końcowej objętości 20 mikrolitrów. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 godzin.