Test chiralności komórek w kształcie pierścienia: technika in vitro do określania chiralności wielokomórkowej na podstawie wyrównania komórek na mikrowzorcach w kształcie pierścienia

Aby określić chiralność komórek ssaków in vitro - odchylenie komórek w lewo i w prawo w celu wyrównania w orientacji w lewo lub w prawo w warunkach ograniczających - należy rozpocząć od specjalnie wyprodukowanych szkiełek pokrytych złotem na płytce wielodołkowej zawierającej pożywkę. Szkiełka składają się z mikrowzorów pierścieniowatych wysp fibronektyny sprzyjającej adhezji komórek, wypełnionych odporną na adhezję komórek samoorganizującą się monowarstwą.

Następnie wysiać odpowiednią objętość zawiesiny komórek ssaków na szkiełka i inkubować. Komórki adsorbują się na mikrowzorcach pierścieniowych zawierających fibronektynę. Otaczająca, samoorganizująca się monowarstwa zapobiega niespecyficznemu przyłączaniu się komórek poza granice pierścienia.

Wymień nośnik, usuwając wszystkie niepodłączone komórki, na nowy nośnik. Dodaj lek zakłócający działanie aktyny do jednego zestawu szkiełek i inkubuj.

Przylegające komórki namnażają się, rozprzestrzeniając się i przyjmując kształt leżących pod spodem wysp fibronektyny, jednocześnie reorganizując swoje włókna aktynowe w odpowiedzi na sygnały przestrzenne, które ograniczają monowarstwę komórki, promując stronnicze wyrównanie.

Teraz potraktuj szkiełka paraformaldehydem w celu utrwalenia komórek. Pod mikroskopią z kontrastem fazowym komórki na mikrowzorcach pierścieniowych pojawiają się jako ciemne obszary z jasnymi konturami ustawionymi zgodnie z ich preferencyjnym odchyleniem.

Za pomocą oprogramowania oblicz kąt wyrównania każdej komórki jako odchylenie od kierunku obwodowego pierścienia. Średnia w celu określenia chiralności komórek ssaków. Komórki leczone aktyną mogą wykazywać odwrotną chiralność choroby.

Przed wysianiem komórek podgrzej pożywkę i trypsynę w łaźni wodnej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza.

Aby uzyskać lepsze przyleganie komórek, namocz wzorzystą szkiełko w 12-dołkowej płytce zawierającej pożywkę hodowlaną i podgrzej ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Gdy komórki zostaną wytrypsynizowane, zneutralizuj je pożywką zawierającą FBS. Osadzaj komórki w ilości 100 x g przez 3 minuty, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy w świeżym podłożu. Policz komórki i rozcieńcz zawiesinę komórek, aby osiągnąć stężenie 200 000 komórek na mililitr.

Dodaj 0,5 mililitra zawiesiny komórek do każdej studzienki zawierającej jedno złote szkiełko. Delikatnie potrząśnij płytką kilka razy, aby uzyskać równomierny wysiew komórek, a następnie inkubuj przez 15 minut w celu przyłączenia komórek. Po 15 minutach sprawdź przyczepienie komórek pod mikroskopem i, jeśli to konieczne, inkubuj jeszcze przez jakiś czas.

Po przyłączeniu komórek odessać pożywkę zawierającą nieprzyłączone komórki z każdej studzienki i dodać 1 mililitr świeżej pożywki hodowlanej. Hoduj komórki w inkubatorze przez 24 godziny i sprawdzaj konfluencję, aby określić, czy utworzyła się chiralności.

Po osiągnięciu wymaganej konfluencji utrwal komórki, usuwając pożywkę hodowlaną. Po jednokrotnym spłukaniu PBS dodać 4% roztwór paraformaldehydu do szkiełka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie ponownie spłukać PBS trzy razy.

Aby uzyskać obrazy, użyj mikroskopu z kontrastem fazowym z funkcją kamery i uchwyć każdy pierścień na szkiełku w wysokiej rozdzielczości.

Aby scharakteryzować chiralności, pobierz pliki kodu MATLAB. Dodaj folder kodu i podfoldery do ścieżki MATLAB i otwórz plik "ROI_selection.m". W wierszu 4 zmień katalog na żądany folder danych.

Zmień rozmiar obrazu w wierszu 14, przy czym pierwsze dwie cyfry reprezentują rozmiar wewnętrznego okręgu pierścienia, a pozostałe dwie reprezentują zewnętrzny.

Aby określić obszar zainteresowania lub ROI na obrazach kontrastu fazowego, wykonaj kod MATLAB "ROI_selection.m" m, klikając przycisk Uruchom. Ręcznie przeciągnij kwadrat zaznaczenia, aby dopasować go do pierścienia, a następnie kliknij dwukrotnie obraz, aby potwierdzić wybór.

Po wybraniu ROI ze wszystkich obrazów w folderze, zostanie wygenerowany plik ".mat" do przechowywania informacji o ROI dla każdego obrazu. Następnie otwórz plik "Analysis_batch.m" i zmień katalog folderu, jak pokazano wcześniej. Kliknij przycisk Uruchom, aby wykonać kod "Analysis_batch.m" w celu określenia chiralności wielu wzorców pierścieni komórkowych.

Zostanie wygenerowany plik "datatoexcel.txt", zawierający statystyki kołowe dla każdego pierścienia, a także liczbę pierścieni zgodnych z ruchem wskazówek zegara, niechiralnych i przeciwnych do ruchu wskazówek zegara.