JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:44 min. • July 8th, 2025
W mitochondriach syntaza cytrynianu, zlokalizowana w macierzy wewnętrznej błony mitochondrialnej, jest enzymem ograniczającym szybkość, który katalizuje reakcję między acetylokoenzymem A a kwasem szczawiooctowym w celu wytworzenia cytrynianu, pierwszego etapu cyklu kwasu cytrynowego.
Aby przeanalizować aktywność syntazy cytrynianu, przenieś dorosłe klatki piersiowe muchy Drosophila obfitujące w mitochondria do probówki wypełnionej schłodzonym buforem ekstrakcyjnym zawierającym kwas etylenodiaminotetraoctowy, EDTA i niejonowy detergent.
Homogenizuj tkanki klatki piersiowej na lodzie, aby zapobiec denaturacji białek za pośrednictwem ciepła. Przyłożona siła ścinająca, w połączeniu z detergentami, powoduje lizę tkanki i uwalnia składniki wewnątrzkomórkowe, w tym mitochondria.
Ponadto pęknięcie wewnętrznej błony mitochondrialnej prowadzi do uwolnienia białek macierzy mitochondrialnej, w tym syntazy cytrynianu. EDTA wiąże się z kationami dwuwartościowymi i hamuje aktywność proteazy, zapobiegając w ten sposób degradacji białek.
Rozcieńczyć homogenat za pomocą buforu ekstrakcyjnego i dodać odpowiednią objętość do mieszaniny reakcyjnej zawierającej studzienki płytki wielodołkowej. Mieszanina reakcyjna składa się z acetylokoenzymu A, kwasu szczawiooctowego i kwasu ditionitrobenzoesowego.
Syntaza cytrynianu w homogenacie katalizuje reakcję między kwasem szczawiooctowym a acetylokoenzymem A, tworząc cytrynian i koenzym A z grupą tiolową. Grupa tiolowa reaguje z bezbarwnym kwasem ditionitrobenzoesowym, tworząc żółty produkt, kwas tionitrobenzoesowy.
Za pomocą czytnika mikropłytek zmierzyć absorbancję roztworu o żółtym kolorze. Absorbancja może być związana z aktywnością syntazy cytrynianu w homogenacie tkankowym.
Natychmiast przenieś 10 dorosłych much do 100 mikrolitrów lodowatego buforu ekstrakcyjnego i homogenizuj je tłuczkiem na lodzie. Utrzymuj próbki w niskiej temperaturze, homogenizując je przez pięć do 10 sekund na lodzie, pozostawiając je na lodzie przez pięć sekund, a następnie powtarzaj, aż wszystkie tkanki zostaną całkowicie zhomogenizowane.
Porcję 10 mikrolitrów każdej homogenizowanej próbki do nowej probówki w celu pomiaru zawartości białka, utrzymując te probówki również na lodzie. Dodaj 400 mikrolitrów lodowatego buforu ekstrakcyjnego do każdej pozostałej próbki, aby uzyskać łączną objętość 500 mikrolitrów, a następnie delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać.
Do każdej reakcji dodać 1 mikrolitr rozcieńczonego lizatu komórkowego do 150 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu reakcyjnego. Dokładnie wymieszaj, delikatnie pipetując, uważając, aby nie tworzyć się pęcherzyków. Następnie za pomocą czytnika płytek mierz absorbancję przy 412 nanometrach co 10 do 30 sekund przez cztery minuty w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
Wykreśl dane jako absorbancję w czasie, a następnie oblicz nachylenie dla liniowej części krzywej. Na koniec podziel szybkość reakcji lub nachylenie przez stężenie białka próbki, aby znormalizować aktywność syntazy cytrynianu.