Test aktywności syntazy cytrynianu: Test kolorymetryczny do pomiaru aktywności syntazy cytazy mitochondrialnej w homogenacie tkanki Drosophila

W mitochondriach syntaza cytrynianu, zlokalizowana w macierzy wewnętrznej błony mitochondrialnej, jest enzymem ograniczającym szybkość, który katalizuje reakcję między acetylokoenzymem A a kwasem szczawiooctowym w celu wytworzenia cytrynianu, pierwszego etapu cyklu kwasu cytrynowego.

Aby przeanalizować aktywność syntazy cytrynianu, przenieś dorosłe klatki piersiowe muchy Drosophila obfitujące w mitochondria do probówki wypełnionej schłodzonym buforem ekstrakcyjnym zawierającym kwas etylenodiaminotetraoctowy, EDTA i niejonowy detergent.

Homogenizuj tkanki klatki piersiowej na lodzie, aby zapobiec denaturacji białek za pośrednictwem ciepła. Przyłożona siła ścinająca, w połączeniu z detergentami, powoduje lizę tkanki i uwalnia składniki wewnątrzkomórkowe, w tym mitochondria.

Ponadto pęknięcie wewnętrznej błony mitochondrialnej prowadzi do uwolnienia białek macierzy mitochondrialnej, w tym syntazy cytrynianu. EDTA wiąże się z kationami dwuwartościowymi i hamuje aktywność proteazy, zapobiegając w ten sposób degradacji białek.

Rozcieńczyć homogenat za pomocą buforu ekstrakcyjnego i dodać odpowiednią objętość do mieszaniny reakcyjnej zawierającej studzienki płytki wielodołkowej. Mieszanin