JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:03 min • July 8th, 2025
W tkance żelazo, niezbędny minerał kluczowy dla różnych procesów metabolicznych, zwykle występuje w sekwestracji do hemoprotein i niehemowych białek żelaza. Hemoproteiny obejmują żelazo lub żelazo hemowe związane z pierścieniami porfiryny, podczas gdy białka żelaza niehemowego nie mają struktury pierścienia porfirynowego i zawierają głównie żelazo żelazowe lub niehemowe.
Aby oszacować zawartość żelaza niehemowego w tkance wątroby myszy, należy potraktować wysuszony, pobrany fragment tkanki wątroby myszy niskimi stężeniami kwasu solnego i kwasu trichlorooctowego. Inkubuj w wysokich temperaturach, aby strawić tkankę i ułatwić wytrącanie białek wywołane kwasem.
Ze względu na niskie stężenia kwasów, żelazo niehemowe jest uwalniane z powiązanych białek. Żelazo hemowe, będąc związane z pierścieniem porfiryny, pozostaje nienaruszone.
Po schłodzeniu przenieść żądaną objętość supernatantu zawierającego żelazo niehemowe na płytkę wielodołkową. Dodać chromogenny chelator żelaza, sulfonian batofenantroliny, BPS, uzupełniony kwasem tioglikolowym, środkiem redukującym, do odpowiedniego buforu i inkubować.
Kwas tioglikolowy redukuje całe żelazo niehemowe do żelaza żelazawego, które może łatwo wiązać się z BPS w stosunku 1:3, tworząc wysoce stabilny kompleks o różowym zabarwieniu. Dodatkowo kwas tioglikolowy zapobiega zakłóceniom powodowanym przez wszelkie zanieczyszczające kationy metali dwuwartościowych, takie jak miedź, które mogą wchodzić w interakcje z BPS.
Umieścić płytkę wielodołkową w czytniku mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję różowych kompleksów żelaza-BPS, reprezentatywnych dla stężenia żelaza niehemowego we fragmencie tkanki wątroby myszy.
Przenieś każdy wysuszony kawałek tkanki do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Dodaj 1 mililitr mieszaniny kwasów do probówki i zamknij ją. Przygotuj ślepą próbę kwasową w ten sam sposób, z wyjątkiem tego, że tutaj pominięto tkankę.
Inkubuj probówki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 godzin, aby strawić tkankę.
Po schłodzeniu do temperatury pokojowej za pomocą mikropipety wyposażonej w plastikowe końcówki przenieść 500 mikrolitrów klarownego ekstraktu kwasowego do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.
Przygotować reakcje chromogenowe bezpośrednio na płaskodennych, 96-dołkowych, przezroczystych, nieobrobionych mikropłytkach polistyrenowych. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
Zmierz absorbancję próbki w czytniku płytek o długości fali 535 nanometrów w stosunku do wody referencyjnej dejonizowanej.