Test jednocząsteczkowy pull-down do analizy fosforylacji białek: wysokoprzepustowa technika ilościowego określania fosforylacji białek w lizacie komórkowym

Fosforylacja niektórych białek komórkowych jest ważna dla ich funkcji biologicznej.

Aby określić ilościowo poziomy fosforylacji nienaruszonych białek za pomocą testu ściągania pojedynczej cząsteczki, zacznij od pobrania szklanego szkiełka nakrywkowego z wzorem siatki. Każdy przedział jest pokryty biotynylowanym glikolem polietylenowym lub łącznikami na bazie PEG rozmieszczonymi w odstępach od normalnego PEG, aby zapobiec przeszkodom sterycznym podczas wiązania białek.

Potraktuj szkiełko nakrywkowe odczynnikiem redukującym, aby zminimalizować autofluorescencję podczas analizy. Na szkiełko nakrywkowe należy nałożyć neutrawidyny - białka wiążące biotynę - i inkubować, umożliwiając im wiązanie biotynylowanych łączników PEG.

Uzupełnij macierz o specyficzne przeciwciała przeciwko białku docelowemu. Każde przeciwciało zawiera biotynę połączoną z regionem Fc, która pomaga zakotwiczyć przeciwciało w neutrawidynie, powodując unieruchomienie.

Teraz dodaj lizat kultury komórkowej zawierający różne białka, w tym zielone fluorescencyjne fosforylowane i niefosforylowane warianty białka docelowego, i inkubuj. Oba warianty białka docelowego są wychwytywane przez przeciwciała, tworząc kompleksy. Umyć, aby usunąć niezwiązane białka.

Następnie potraktuj te kompleksy drugim zestawem przeciwciał znakowanych czerwoną fluorescencją, które wiążą wyłącznie fosforylowane reszty białka, przekazując kompleksowi inny sygnał fluorescencyjny.

Zobrazuj matrycę pod mikroskopem fluorescencyjnym i obserwuj dwa różne sygnały fluorescencyjne. Kolokalizacja obu sygnałów fluorescencyjnych wskazuje na obecność fosforylowanych białek w próbce.

Wyjmij z zamrażarki tablice funkcjonalizowane biotyną-PEG i wyrównaj je do temperatury pokojowej. Umieść szkiełko nakrywkowe z matrycą skierowaną do góry na 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych wyłożonym folią uszczelniającą. Inkubować każdy kwadrat tablicy z 10 miligramami na mililitr borowodorku sodu i PBS przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Umyj trzykrotnie PBS.

Następnie inkubować z 0,2 miligrama na mililitr NeutrAwidyny w T50 przez 5 minut, a następnie trzykrotnie przemyć T50-BSA. Powtórzyć inkubację z 2 mikrogramami na mililitr biotynylowanego przeciwciała specyficznego dla POI w T50-BSA przez 10 minut, a następnie przemyć.

Najpierw rozmrozić i wymieszać lizat przez pipetowanie. Rozcieńczyć 1 mikrolitr lizatu w 100 mikrolitrach lodowatego T50-BSA/PPI. Inkubować lizat na matrycy przez 10 minut, a następnie przemyć. Przygotować przeciwciało antyfosfotyrozynowe sprzężone z AF647 w lodowatym T50-BSA/PPI i inkubować na matrycy przez 1 godzinę.

Umieść kroplę oleju na celu. Umieść nanosiatkę na stoliku w celu obrazowania. Korzystając z przechodzącego białego światła, skup się na wzorze siatki. Zrób serię 20 obrazów siatki. Upewnij się, że piksele nie są nasycone, i zapisz serię obrazów jako "Fikcyjną".

Rozogniskuj nanosiatkę, aby utworzyć wzór Airy. Uzyskaj serię 20 obrazów do kalibracji wzmocnienia i zapisz obraz jako "Wzmocnienie". Następnie uzyskaj serię 20 obrazów do przesunięcia kamery, blokując całe światło wpadające do aparatu, i zapisz obraz jako "Tło".

Aby uzyskać obrazy SiMPull, najpierw wyczyść obiektyw olejowy i nałóż na niego dodatkową ilość oleju. Zamocuj matrycę szkiełek nakrywkowych na stoliku mikroskopu. Uzyskaj obrazy dla każdej próbki, najpierw w kanale dalekiej czerwieni, a następnie we fluoroforach o niższej długości fali. Sprawdzaj poziom buforu co 30 do 45 minut i uzupełniaj w razie potrzeby.