Test jednocząsteczkowy pull-down do analizy fosforylacji białek: wysokoprzepustowa technika ilościowego określania fosforylacji białek w lizacie komórkowym
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:14 min. • July 8th, 2025
Fosforylacja niektórych białek komórkowych jest ważna dla ich funkcji biologicznej.
Aby określić ilościowo poziomy fosforylacji nienaruszonych białek za pomocą testu ściągania pojedynczej cząsteczki, zacznij od pobrania szklanego szkiełka nakrywkowego z wzorem siatki. Każdy przedział jest pokryty biotynylowanym glikolem polietylenowym lub łącznikami na bazie PEG rozmieszczonymi w odstępach od normalnego PEG, aby zapobiec przeszkodom sterycznym podczas wiązania białek.
Potraktuj szkiełko nakrywkowe odczynnikiem redukującym, aby zminimalizować autofluorescencję podczas analizy. Na szkiełko nakrywkowe należy nałożyć neutrawidyny - białka wiążące biotynę - i inkubować, umożliwiając im wiązanie biotynylowanych łączników PEG.
Uzupełnij macierz o specyficzne przeciwciała przeciwko białku docelowemu. Każde przeciwciało zawiera biotynę połączoną z regionem Fc, która pomaga zakotwiczyć przeciwciało w neutrawidynie, powodując unieruchomienie.
Teraz dodaj lizat kultury komórkowej zawierający różne białka, w tym zielone fluorescencyjne fosforylowane i niefosforylowane warianty białka docelowego, i inkubuj. Oba warianty białka docelowego są wychwytywane przez przeciwciała, tworząc kompleksy. Umy
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych