Test dwuwarstwowy lipidów ze sferycznym wsparciem: technika obserwacji składania się septyny na mikrosferach

Septyny są kluczowymi białkami cytoszkieletu, które wiążą się z zakrzywionymi powierzchniami błony plazmatycznej.

Aby zaobserwować in vitro składanie septyny na mikrosferach, najpierw weź zawiesinę mikroskopijnych kulek krzemionkowych o jednolitych rozmiarach, działających jako solidne podparcie dla tworzenia dwuwarstw. Odwiruj to zawiesinę, aby rozbić wszelkie skupiska koralików.

Uzupełnij go małymi pęcherzykami jednowarstwowymi, SUV - kulistymi pęcherzykami otoczonymi pojedynczą dwuwarstwą lipidową. Inkubować przy ciągłym mieszaniu, zapobiegając osiadaniu mikrosfer.

Podczas inkubacji zewnętrzne grupy głów biegunowych ułatwiają adsorpcję SUV-ów na powierzchni hydrofilowej mikrosfery. Ta interakcja powoduje pękanie SUV-ów, a następnie fuzję lipidów SUV z zakrzywioną powierzchnią mikrosfery jako ciągłą warstwę, w wyniku czego powstaje sferyczna, podparta dwuwarstwa lipidowa, SLB.

Przemyć w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanych lipidów i ponownie zawiesić w buforze reakcyjnym. Przenieś sferyczną zawiesinę SLB na mały obszar powierzchni pokrytej glikolem polietylenowym, aby zapobiec niespecyficznej adsorpcji. Dodać znakowaną fluorescencyjnie zawiesinę septyny do komory i inkubować.

Septyny tworzą heterooligomery, które rozpoznają dodatnią krzywiznę sferycznych SLB, polimeryzując w celu utworzenia włókien. W końcu włókna septyny oddziałują ze sobą, prowadząc do powstania struktur wyższego rzędu.

Obserwuj SLB pokryte septyną pod mikroskopem fluorescencyjnym o wysokiej rozdzielczości. Obecność fluorescencji wskazuje na osadzanie się septyny wrażliwe na krzywiznę.

Najpierw wiruj butelkę zawierającą mikrosfery krzemionki przez 15 sekund. Następnie należy poddać kąpieli sonikacji przez minutę i ponownie wirować przez 15 sekund, aby rozbić wszelkie skupiska. Wymieszaj kulki z SLBB i 10 mikrolitrami 5-milimolowych SUV-ów w probówce mikrowirówkowej o niskiej przyczepności.

Inkubować mieszaninę kulek i lipidów przez godzinę w temperaturze pokojowej, na wytrząsarce, aby zapobiec sedymentacji. W międzyczasie rozmrozić PEGylowane szkiełko nakrywkowe i przyklej do niego wyciętą 0,2-mililitrową probówkę PCR. Po inkubacji odwirować kulki przez 30 sekund w wyznaczonym RCF.

Po pierwszym wirowaniu usunąć 50 mikrolitrów supernatantu. Następnie dodaj 200 mikrolitrów PRB i wymieszaj energicznie pipetując. W następnych rundach usuń 200 mikrolitrów PRB i dodaj kolejne 200 mikrolitrów po drugim i trzecim wirowaniu oraz dodaj 220 mikrolitrów PRB po czwartym wirowaniu.

Jeśli wykonujesz test konkursowy z wieloma rozmiarami kulek, przygotuj reakcję, mieszając równe objętości każdego rozmiaru kulki i rozcieńczając 29 mikrolitrów tej mieszaniny kulek 721 mikrolitrami buforu reakcyjnego. Następnie dodaj 75 mikrolitrów rozcieńczonych kulek i 25 mikrolitrów białka rozcieńczonego w SSB do studzienek i wymieszaj.

W przypadku pomiaru septyn w stanie ustalonym, inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez godzinę, a następnie zobrazuj za pomocą mikroskopii bliskiej TIRF lub konfokalnej.