JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:38 min. • July 8th, 2025
Jądrowe białka wiążące RNA, RBP, są wielofunkcyjnymi białkami złożonymi z uporządkowanych regionów o dobrze zdefiniowanej, trójwymiarowej strukturze i mniej stabilnych, wewnętrznie nieuporządkowanych regionów, IDR.
W kilku chorobach neurodegeneracyjnych mutacje specyficzne dla IDR powodują nieprawidłową lokalizację RBP w cytoplazmie i nieprawidłowo angażują się w słabe interakcje, tworząc dynamiczne, pozbawione błony inkluzje - zjawisko zwane separacją faz. W końcu inkluzje te dojrzewają do postaci toksycznych, nierozpuszczalnych agregatów, co prowadzi do dysfunkcji neuronów i zwyrodnienia.
Aby zbadać separację faz RBP in vivo przy użyciu optogenetyki, należy rozpocząć od znieczulonej, zdechorionowanej transgenicznej larwy danio pręgowanego, wyrażającej zmutowany przez IDR RBP połączony z fluorescencyjnym reporterem i wrażliwą na niebieskie światło domeną fotoreceptora, w odpowiednim buforze.
Następnie zamontuj larwę bocznie na kropli stopionej agarozy w celu obrazowania rdzenia kręgowego. Pozwól agarozie zestalić się, unieruchamiając larwę. Za pomocą mikroskopu konfokalnego uzyskaj obrazy rdzenia kręgowego, aby uwidocznić fluorescencyjne RBP, zlokalizowane w jądrach neuronalnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych