JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:08 min • July 8th, 2025
Angiogeneza to tworzenie nowych naczyń krwionośnych z istniejących naczyń krwionośnych w stanach rozwojowych i patologicznych. Rozległa komunikacja między komórkami śródbłonka, które wyściełają wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych, a otaczającymi perycytami - komórkami podtrzymującymi po zewnętrznej stronie naczyń krwionośnych - ma kluczowe znaczenie dla angiogenezy.
Aby zbadać angiogenezę in vitro, zacznij od komórek śródbłonka i pokrytych perycytami kulek mikronośnikowych zawieszonych w roztworze fibrynogenu - rozpuszczalnej glikoproteiny, która działa jako prekursor fibryny.
Teraz odpipetuj zawiesinę kulek do płytki hodowlanej zawierającej roztwór trombiny - enzymu proteolitycznego i inkubuj. Trombina wiąże się z cząsteczką fibrynogenu, powodując jej rozszczepienie do tworzenia nierozpuszczalnych monomerów fibryny, tworząc polimerowy żel fibrynowy. Ten etap zapewnia zatopienie kulek pokrytych komórkami w żelu fibryny.
Następnie umieść kulturę fibroblastów - komórek prekursorowych tkanki łącznej - na żelu fibrynowym i inkubuj, aby umożliwić aktywację fibroblastów.
Podczas inkubacji fibroblasty wydzielają kluczowe czynniki angiogenno-wzrostowe, które wyzwalają aktywację komórek śródbłonka. W połączeniu przylegające perycyty i komórki śródbłonka wydzielają cząsteczki sygnałowe, które pomagają w kiełkowaniu komórek śródbłonka w żelu fibryny.
Kiełki śródbłonka pojawiają się jako wydłużone wypukłości komórek owinięte wokół perycytów, przedstawiające wczesny etap angiogenezy.
Zbadaj talerze kulek pokrytych mikronośnikiem pod mikroskopem pod 20-krotnym powiększeniem, aby potwierdzić, że wszystkie kulki zostały wystarczająco pokryte przez komórki śródbłonka.
Przenieść płytki do okapu z przepływem laminarnym i za pomocą pipety P1000 energicznie zassać i dozować roztwory powlekanych kulek w celu odłączenia komórek od dna płytki i przeniesienia supernatantów do pojedynczych probówek.
Pozwól koralikom osiąść na dnie rurek przez trzy minuty. Następnie użyj pipety P1000, aby usunąć jak najwięcej supernatantów bez naruszania klastrów kulek. Ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze kompletnego podłoża na probówkę i pozostawić kulki na 30 do 60 sekund. Za pomocą pipety P1000 ponownie zassać supernatant i przemyć swobodnie unoszące się komórki śródbłonka z zawiesiny kulek świeżą, kompletną pożywką, jeszcze dwa razy, jak pokazano.
Po trzecim praniu ponownie zawieś kulki w 2,5 mililitra roztworu fibrynogenu. Dodaj 13 mikrolitrów roztworu trombiny na studzienkę w 24-dołkowej szklanej płycie dennej. Następnie dodaj 0,5 mililitra roztworu kulki/fibrynogenu do każdej studzienki, uważając, aby ostrożnie pipetować kulki bezpośrednio do trombiny i powoli pipetować w górę iw dół dwa do trzech razy, aby dokładnie wymieszać roztwory.
Po wysianiu wszystkich studzienek należy pozostawić roztwór trombiny i fibrynogenu do wstępnego skrzepnięcia w okapie z przepływem laminarnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dodatkowe 1,5 do 2 godzin.
Gdy żel całkowicie zestali, ponownie zawieś normalne ludzkie fibroblasty płuc w stężeniu 2 x 104 komórek na mililitr w kompletnym pożywce i dodaj jeden mililitr fibroblastów do każdej studzienki. Następnie należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.