JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:55 min. • July 8th, 2025
Aby ocenić potencjał badanego związku larwobójczego, antagonista receptora dopaminy, stosując test kontaktowy larw, rozpoczyna się od żywych larw komarów w pożądanym stadium rozwojowym lub początkowym w środowisku wodnym. Przenieś równą liczbę larw do studzienek płytki wielodołkowej.
Zastąp pożywkę w studniach wodą dejonizowaną, aby zapobiec wszelkim zakłóceniom powodowanym przez zanieczyszczenia, które mogą negatywnie wpłynąć na larwy. Dodać rosnące stężenia badanego związku do odpowiednich studzienek.
Delikatnie zakręć płytką, aby ułatwić kontakt między larwami a badanym związkiem. Inkubować płytkę w odpowiednich warunkach.
W kontakcie z larwami badany związek wnika w ścianę ciała lub najbardziej zewnętrzną warstwę i dociera do przetchlinek, otworów układu tchawicy, które są połączone ze zwojami - skupiskiem komórek nerwowych - składającymi się na ośrodkowy układ nerwowy.
Na komórkach nerwowych badany związek wiąże się z drugorzędowymi miejscami wiązania receptorów dopaminy, które biorą udział w krytycznych procesach komórkowych. To wiązanie, nawet z neuroprzekaźnikiem dopaminą związanym z receptorem dopaminy, zapobiega aktywacji receptora i dalszej sygnalizacji, zakłócając rozwój larw, ostatecznie powodując śmierć.
Zapisać liczbę larw niereagujących, pozbawionych ruchu, w każdym studzienku w określonym punkcie czasowym po ekspozycji na badany związek w różnych stężeniach.
Zwiększona śmiertelność larw wraz ze wzrostem stężenia wskazuje na potencjał larwobójczy badanego związku.
Na początek oznacz studzienki przezroczystej 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Użyć wagi analitycznej do zważenia badanego związku. Następnie rozpuść związek w sterylnej, podwójnie destylowanej wodzie w 1,5-mililitrowej probówce, dając 80-milimolowy roztwór podstawowy. Następnie należy seryjnie rozcieńczyć roztwór podstawowy za pomocą podwójnie destylowanej wody, aby przygotować robocze roztwory podstawowe o pożądanych stężeniach.
Należy zauważyć, że należy zachować ostrożność podczas dodawania larw do studzienek, podczas usuwania nadmiaru wody oraz po dodaniu chemii testowej, aby uniknąć fizycznego uszkodzenia larw. Uraz może zwiększyć śmiertelność, a tym samym dać fałszywie dodatnie wyniki lub unieważnić test.
Użyj plastikowej pipety transferowej o szerokim otworze, aby przenieść pięć larw trzeciego stadium do każdego dołka płytki. Następnie użyj pipety o pojemności 1 mililitra, aby delikatnie usunąć wodę i zastąp ją żądaną objętością podwójnie destylowanej wody.
Uważaj, aby nie dotykać larw podczas usuwania wody. Pracuj szybko, aby upewnić się, że larwy nie wysychają, i delikatnie dodaj testową chemię, pipetując do przeciwnej strony plastikowej studzienki.
Dodać odpowiednią objętość roztworu testowego do każdego dołka i delikatnie obrócić płytkę, aby zapewnić równomierne wymieszanie. Umieść płytkę w komorze wzrostowej, utrzymując 12-godzinny cykl światło-ciemność w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności względnej od 75% do 85%.
Aby sprawdzić ruch larw, delikatnie postukaj w płytkę. Jeśli nie zaobserwujesz żadnego ruchu, delikatnie dotknij larwy sterylną wykałaczką. Oznacz larwę jako martwą, jeśli nie zauważysz żadnej reakcji, i użyj arkusza punktacji, aby zapisać całkowitą liczbę martwych larw w każdej studzience w punktach czasowych opisanych w protokole tekstowym.