Test do badań miejscowych: technika oceny potencjału owadobójczego antagonistów receptora dopaminy u dorosłych samic komarów poprzez zastosowanie miejscowe

Test badań miejscowych u komarów polega na bezpośrednim osadzaniu aktywnego związku testowego na grzbietowej klatce piersiowej dorosłych komarów w celu zbadania jego właściwości owadobójczych.

Na początek znieczulij dorosłe samice komarów, wystawiając je na krytyczne minimum termiczne - niską temperaturę, która zatrzymuje ich aktywność nerwowo-mięśniową.

Umieść pojedyncze znieczulone samice komarów pod mikroskopem preparacyjnym. Weź szklaną strzykawkę podłączoną do mikroaplikatora wypełnioną badanym związkiem - antagonistą receptora dopaminy - w rozpuszczalniku niepolarnym. Umieścić igłę w pobliżu klatki piersiowej i za pomocą mikroaplikatora ostrożnie nanieść kroplę badanego związku na powierzchnię grzbietową.

Po aplikacji przenieś leczone komary do komory wzrostowej o kontrolowanych warunkach środowiskowych na określony czas.

Niepolarny rozpuszczalnik zawarty w kropelce rozpuszcza lipidy w naskórku - zewnętrznej powłoce - umożliwiając wniknięcie związku do środka. Związek przenika przez warstwę naskórka znajdującą się pod spodem i dociera do zwojów piersiowych – gęstej grupy komórek nerwowych połączonych z układem nerwowym.

Po dotarciu do komórek nerwowych związek wiąże się z miejscem allosterycznym - dodatkowym miejscem wiązania cząsteczek regulatorowych - na receptorze dopaminy. Wiązanie allosteryczne utrudnia kaskadę sygnalizacyjną po związaniu się z dopaminą - neuroprzekaźnikiem kontrolującym krytyczne procesy biologiczne - prowadząc do śmierci.

Po zakończeniu doświadczenia należy zanotować liczbę martwych komarów - leczonych osobników pozbawionych ruchu - w celu oceny potencjału owadobójczego badanego związku.

Hodowla 3 do 5-dniowych dorosłych komarów w 20-litrowej plastikowej klatce. Oznacz 9-uncjowe kubki papierowe nazwą i stężeniem badanego związku.

Następnie należy przygotować 10 μg/μl roztworu podstawowego badanego związku w acetonie w szklanej fiolce o pojemności 20 mililitrów. Następnie należy seryjnie rozcieńczyć roztwór podstawowy, aby uzyskać pożądane stężenia robocze.

Oczyść szklaną strzykawkę o pojemności 1 mililitra acetonem, a następnie napełnij ją roztworem testowym o odpowiednim stężeniu. Zabezpiecz strzykawkę w mikroaplikatorze dostosowanym do objętości 0,25 mikrolitra.

Następnie za pomocą aspiratora wyjmij z klatki dziesięć 3-5-dniowych dorosłych samic komarów i znieczulaj je przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie przenieś komary na szalkę Petriego i umieść naczynie na lodzie na 10 minut.

Aby uniknąć uszkodzenia dorosłego komara, co mogłoby przyczynić się do śmiertelności, upewnij się, że nie są one znieczulone w lodówce na dłużej niż 5 minut lub unieruchomione na lodzie na dłużej niż 10 i zminimalizuj obchodzenie się z komarami. Jeśli masz dostęp do zimnej płyty i mikromanipulatora z ruchomym stolikiem, może to jeszcze bardziej zminimalizować obchodzenie się z komarami.

Użyj cienkiej pęsety, aby usunąć każdego komara z naczynia. Za pomocą mikroaplikatora strzykawkowego nanieść 0,25 mikrolitra roztworu testowego na grzbietową część klatki piersiowej pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie przenieś komary do oznaczonego papierowego kubka na lodzie. Uszczelnij kubek kwadratem o wymiarach 10 na 10 centymetrów i gumką. Następnie przenieś go do komory wzrostowej i zapisz liczbę martwych komarów.