JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:38 min • July 8th, 2025
Endotoksyna, Gram-ujemna toksyna bakteryjna obecna na błonie zewnętrznej, jest lipopolisacharydem, LPS, składającym się głównie z lipidów i polisacharydów, w tym lipidu A i antygenu O. Po uwolnieniu podczas infekcji jest rozpoznawany przez układ odpornościowy, wywołując reakcje zapalne oparte na cytokinach.
Aby oszacować zanieczyszczenie endotoksynami w nanopreparacie leku liposomalnego przy użyciu lizatu amebocytów Limulus, LAL, test, należy przygotować probówki reakcyjne, z których jedna zawiera lek, a druga zawiera lek wzbogacony znanym stężeniem endotoksyny.
Dodaj odczynnik LAL zawierający lizat białkowy uzyskany z kraba podkowiastego, Limulus polyphemus, komórek krwi lub amebocytów. Lizat zawiera nieaktywne proteazy serynowe - czynnik B, czynnik C, enzym proklotowy - oraz białko krzepnięcia żelu, koagulogen.
Zwiruj rurki i załaduj je do mętnościomierza, aby zmierzyć zmętnienie roztworów.
W obecności zanieczyszczającego LPS związanego z lekami liposomalnymi, wrażliwy na LPS czynnik C ulega autokatalitycznie aktywacji, która następnie rozszczepia i aktywuje czynnik B, który przekształca enzym prokrzepnięcia w enzym krzepnięcia. Ten aktywowany enzym rozszczepia wiązania peptydowe koagulogenu, tworząc monomery koaguliny.
Ostatecznie monomery polimeryzują poprzez interakcje między odsłoniętymi hydrofobowymi obszarami na głowie jednego z nich a hydrofobowym ogonem drugiego, co prowadzi do agregacji i tworzenia nierozpuszczalnego, mętnego żelu koagulinowego. Zmierzone zmętnienie pomaga określić stężenie endotoksyn w nanopreparacie.
Obliczone odzyskiwanie skoków po stężeniach endotoksyn w próbkach wzbogaconych i badanych w dopuszczalnym zakresie wskazuje na brak poważnych zakłóceń ze strony nanopreparatu, co potwierdza obecność endotoksyn w leku o nanoformule.
Do przygotowania wzorca kalibracyjnego należy użyć 900 mikrolitrów lizatu amebocytów Limulus lub wody klasy LAL oraz 100 mikrolitrów kontrolnej wzorcowej endotoksyny, aby przygotować tyle rozcieńczeń pośrednich, ile potrzeba, aby umożliwić przygotowanie wzorca kalibracyjnego o stężeniu jednej jednostki endotoksyny na mililitr.
Następnie, używając 900 mikrolitrów wody klasy LAL i 100 mikrolitrów jednego wzorca kalibracyjnego endotoksyny na mililitr, przygotuj drugi wzorzec kalibracyjny o stężeniu 0,1 jednostki endotoksyny na mililitr.
Następnie powtórz seryjne 10-krotne rozcieńczenie, aby przygotować dwa niższe wzorce kalibracyjne, aby uzyskać w sumie cztery wzorce kalibracyjne w zakresie od 0,001 do 1 jednostki endotoksyny na mililitr.
Aby przygotować kontrolę jakości 0,05 jednostki endotoksyny na mililitr, połącz 50 mikrolitrów jednej jednostki endotoksyny na mililitr wzorcowego roztworu kontrolnego endotoksyny z 950 mikrolitrami wody klasy LAL.
Następnie w oprogramowaniu wybierz "Ustawienia instrumentu" i utwórz szablon. Wybierz opcję "Zbieraj dane" i wprowadź identyfikator testu oraz grupę danych w zakładce "Ogólne". Na karcie "Sprzęt" wybierz typ urządzenia i metodę LAL, a następnie sprawdź, czy na ekranie pojawia się numer seryjny, identyfikator systemu i informacje o porcie szeregowym.
Kliknij "OK" dwa razy, aby potwierdzić wybór urządzenia i komunikację z urządzeniem, a następnie wprowadź identyfikatory próbek w tej samej kolejności, w jakiej próbki będą testowane. Następnie użyj domyślnych przycisków, aby wprowadzić kontrolę ujemną, krzywą wzorcową i próbki testowe.
Dodać odpowiednią objętość wzorców kalibracji kontroli ujemnej i kontroli jakości do zduplikowanych, wstępnie oznakowanych szklanych probówek, a następnie dodać odpowiednią objętość LAL do pierwszej fiolki testowej. Krótko przemieszać fiolkę i umieścić fiolkę w odpowiednich szczelinach testowych w karuzeli instrumentów.
Przed załadowaniem próbek należy wykonać kilka rozcieńczeń badanego nanomateriału w maksymalnym dopuszczalnym rozcieńczeniu, jak pokazano.