JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:49 min. • July 8th, 2025
Enzymy rozkładające węglowodany rozkładają złożone polisacharydy na mniejsze oligosacharydy.
Aby zbadać aktywność degradacji enzymu, zacznij od pobrania wielu chromogennych hydrożeli polimerowych, CPH, które są przygotowywane przez barwienie polisacharydów różnokolorowymi barwnikami chlorotriazynowymi. Każdy polisacharyd jest następnie chemicznie sieciowany w celu utworzenia hydrożelu - syntetycznego substratu do degradacji enzymatycznej.
Teraz dozuj różne substraty CPH do różnych studzienek porowatej płytki reakcyjnej. Dodaj roztwór aktywacyjny i inkubuj go, aby zapewnić optymalną aktywację substratów.
Umieścić płytkę testową na pustej płytce produktu. Odwirować płytki razem z niską prędkością, aby ułatwić skuteczne usuwanie roztworu aktywacyjnego przez pory płytki reakcyjnej.
Następnie uzupełnij wszystkie studzienki płytki reakcyjnej tym samym typem enzymu rozkładającego węglowodany w odpowiednim buforze, który utrzymuje optymalne pH dla aktywności enzymatycznej. Uszczelnić płytkę i inkubować ją z łagodnym mieszaniem, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie enzymów w sieci polimerowej, umożliwiając im dostęp do substratu.
Podczas inkubacji enzym, przy odpowiedniej aktywności w stosunku do substratu, rozkłada polisacharydy w CPH do wytworzenia mniejszych oligosacharydów związanych z barwnikiem. Produkty te są rozpuszczalne, dzięki czemu roztwór jest zabarwiony. Zakręć płytki, aby zebrać kolorowy roztwór do płytki produktu.
Spektrofotometrycznie określić absorbancję produktu w celu pomiaru aktywności enzymu.
Aby rozpocząć, aktywuj 96-dołkową płytkę zestawu do oznaczania filtrów, dodając 200 mikrolitrów roztworu aktywacyjnego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej bez mieszania przez 10 minut.
Do zbierania należy użyć wirówki i dowolnej standardowej płytki 96-dołkowej, aby odwirować istniejący roztwór aktywacyjny. Dodaj 100 mikrolitrów sterylnej wody do substratów Chromogenic Polymer Hydrogel lub CPH i zastosuj próżnię lub wirowanie, aby usunąć stabilizator. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
Aby przygotować reakcję enzymatyczną, dodaj 150 mikrolitrów 100-milimolowego buforu octanu sodu o pH 4,5 i 5 mikrolitrów roztworu endocelulazy o trzech różnych stężeniach do każdego dołka płytki zestawu do oznaczania.
Umieść płytkę produktu pod płytką zestawu testowego, aby zebrać wszelkie potencjalne wycieki z płytki reakcyjnej podczas wytrząsania. Następnie inkubować płytkę zestawu do oznaczania w temperaturze pokojowej w wytrząsarce poziomej przy 100 obr./min przez 30 minut.
Aby uzyskać wiarygodne dane, konieczne jest mieszanie mieszaniny reakcyjnej podczas inkubacji.
Umieścić płytkę zestawu do oznaczania z płytką produktu znajdującą się pod nią w wirówce i wirować w dół przy 2 700 x g przez 10 minut, aby przenieść produkt reakcji do dołków płytki produktu.
Po wirowaniu sprawdź wzrokowo tabliczkę produktu, aby sprawdzić, czy objętość cieczy w każdej studzience jest w przybliżeniu taka sama. Za pomocą czytnika płytek odczytaj absorbancję płytki zbiorczej przy 630 nanometrach dla różnych zielonych podłoży CPH.