JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:31 min • July 8th, 2025
Mitokany to klasa leków, które selektywnie wpływają na funkcjonowanie mitochondriów w komórkach nowotworowych i indukują apoptozę.
Aby określić cytotoksyczność mitokanu, należy umieścić zawiesinę komórkową zawierającą częściowo przylegające komórki rakowe na płytce wielodołkowej. Potraktuj płytkę pożądanym roztworem mitokanu i inkubuj.
Mitokan wnika do komórki rakowej, aby zakłócić jej aktywność mitochondrialną, co ostatecznie prowadzi do śmierci komórki w komórkach rakowych wrażliwych na mitokan. Potraktuj komórki roztworem barwiącym zawierającym mieszaninę barwnika Hoechst i jodku propidyny.
Hoechst, przepuszczalny przez błonę barwnik fluorescencyjny, przenika do wszystkich komórek i wiąże się z regionem bogatym w AT ich DNA, nadając niebieską fluorescencję jądrom zarówno żywych, jak i martwych komórek.
Natomiast jodek propidyny, nieprzepuszczalny dla błony barwnik fluorescencyjny, dostaje się do martwych komórek wyłącznie przez uszkodzone części ich błon. Barwnik interkaluje między zasadami DNA, nadając martwym komórkom dodatkową czerwoną fluorescencję. Obecność obu barwników w jądrach tych komórek sprawia, że martwe komórki wydają się fioletowe.
Odwiruj płytkę z niską prędkością, aby osadzić komórki w celu zwiększenia dokładności podczas obrazowania. Obraz pod mikroskopem fluorescencyjnym i obserwuj dwie odrębne populacje komórek. Policz liczbę obu typów komórek.
Odsetek fioletowych komórek reprezentujących populację zmarłą w porównaniu z populacją ogółem wskazuje na potencjał cytotoksyczny badanego mitokanu.
Zacznij od przygotowania roztworów interesujących Cię związków o pożądanym stężeniu. Zawsze upewnij się, że mieszasz związki poprzez dokładne wirowanie.
Aby zmierzyć cytotoksyczność pojedynczego związku, należy przygotować związki o 2-krotnym stężeniu końcowym. W przypadku pomiaru cytotoksyczności kombinacji związków, należy przygotować je w 4-krotnym stężeniu końcowym.
Przygotować kontrole zawierające tylko rozpuszczalnik, mieszając tę samą ilość rozpuszczalnika z odpowiednim podłożem. Zbierz komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki i podwielokrotnie 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do barwienia błękitem trypanowym. Dodaj 10 mikrolitrów 0,4% błękitu trypanowego do podwielokrotności i użyj hemocytometru lub licznika komórek, aby policzyć komórki żywotne i nieżywotne.
Osad komórki w 15-mililitrowej probówce o stężeniu 200 x g przez 5 minut, a następnie odessać lub zdekantować supernatant. Zawiesić osad komórkowy w pożywce odpowiedniej do oznaczania o gęstości komórek 3x105 komórek na mililitr. Użyj pipety wielokanałowej, aby zasiać 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki.
W przypadku testów jednoskładnikowych dodaj 50 mikrolitrów roztworu związku 2X do każdej studzienki. W przypadku studzienek kontrolnych rozpuszczalnika dodać 50 mikrolitrów pożywki testowej zawierającej rozpuszczalnik o stężeniu 2X. W przypadku testów kombinowanych dodaj 25 mikrolitrów każdego ze związków 4X do każdej studzienki. W przypadku pojedynczych studzienek kontrolnych należy dodać po 25 mikrolitrów roztworu związku 4X i pożywki testowej. Upewnij się, że końcowe stężenie DMSO nie przekracza 0,5%.
Aby zapewnić odtwarzalność, dodawaj leki tak, aby końcówka pipety dotykała boku studzienek, uważając, aby dodać leki w różnych miejscach. Ten krok należy wykonać bardzo szybko, najlepiej nie dłużej niż 30 minut na płytkę.
Delikatnie postukaj w płytkę, aby wymieszać zawartość studzienek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Gdy będziesz gotowy do barwienia komórek Hoechst 33342 i jodkiem propidyny, przygotuj świeży 10-krotny roztwór barwiący i dodaj 10 mikrolitrów do każdej studzienki. Delikatnie postukaj w płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Odwirować płytkę o sile 200 x g przez 4 minuty, aby wszystkie komórki znalazły się na dnie płytki. Następnie ostrożnie przetrzyj spód płytki wilgotną chusteczką laboratoryjną, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, które mogą zakłócać obrazowanie. Zobrazuj płytkę w ciągu 15 minut po odwirowaniu.