JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:24 min • July 8th, 2025
Adenozynotrifosforan (ATP), podstawowe źródło energii komórki, jest niezbędny dla różnych funkcji komórkowych. Pod wpływem stresu negatywnie wpływa to na wewnątrzkomórkowy poziom ATP, co sprawia, że ATP jest dobrym markerem dla metabolicznie aktywnych, żywotnych komórek.
Na początek umieść zawiesinę komórek nowotworowych w czarnościennej mikropłytce z przezroczystym dnem, aby zminimalizować rozpraszanie światła podczas pomiaru natężenia światła. Mikropłytka składa się z powłoki hydrożelowej, która zapobiega przyleganiu komórek do płytki, umożliwiając interakcję między komórkami i samoorganizację w organoidy nowotworowe - trójwymiarowe kultury tkankowe, które naśladują mikrośrodowisko guza.
Następnie potraktuj badanym związkiem. Badany związek oddziałuje z komórkami organoidowymi i, w zależności od jego potencjału hamującego wzrost, może zakłócać procesy metaboliczne wytwarzające energię, powodując wewnątrzkomórkowe wyczerpanie ATP.
Po obróbce dodaj jednoetapowy odczynnik składający się z detergentów, inhibitorów ATPazy, enzymu lucyferazy, substratu specyficznego dla lucyferazy, lucyferyny i jonów magnezu. Inkubuj przez żądany czas.
Detergent rozpuszcza błony komórkowe, powodując lizę komórek i ekstrakcję ATP do roztworu, podczas gdy inhibitory ATPazy dezaktywują uwolnione endogenne ATPazy, stabilizując ATP.
Po ekstrakcji ATP, w obecności jonów magnezu, ułatwia lucyferynie wiązanie się z lucyferazy, która utlenia lucyferynę do wysokoenergetycznej oksylucyferyny, która po relaksacji generuje bioluminescencyjny foton.
Za pomocą luminometru zmierz natężenie światła wytwarzanego przez fotony, reprezentatywne dla wewnątrzkomórkowego stężenia ATP. Mniejsze ilości ATP wskazują na niższą żywotność komórek, co sugeruje wyższy potencjał hamujący wzrost badanego związku.
Po 24 godzinach od zmiany pożywki zmielić organoidy nowotworowe za pomocą przyrządu do fragmentacji i dyspersji komórek, wyposażonego w uchwyt filtra zawierający filtr siatkowy o średnicy 70 mikrometrów. Rozcieńczyć 15 milimetrów zawiesiny organoidów nowotworowych 10 razy.
Użyj dozownika zawiesiny komórkowej, aby wysiać 40 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny organoidów nowotworowych w 384-dołkowej mikropłytce sferoidalnej o bardzo niskim nasadce.
Po 24 godzinach za pomocą urządzenia do obsługi cieczy dodać 0,04 mikrolitra roztworów czynnika testowego z 10 seryjnych rozcieńczeń w końcowych zakresach stężeń od 20 mikromolowych do 1,0 nanomolowych w studzienkach i inkubować płytkę przez 6 dni.
Pod koniec inkubacji dodać wewnątrzkomórkowy odczynnik do pomiaru ATP do studzienek testowych. Za pomocą miksera wymieszaj zawartość płytki i inkubuj płytkę przez 10 minut w temperaturze około 25 stopni Celsjusza. Użyj czytnika płytek, aby zmierzyć wewnątrzkomórkową zawartość ATP jako luminescencję.