JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:29 min. • July 8th, 2025
Komórki jelitowe wytwarzają reaktywne formy tlenu - ROS. Umiarkowane poziomy ROS utrzymują homeostazę komórkową, podczas gdy wysokie poziomy ROS mogą powodować śmierć komórki.
Aby określić ilościowo poziomy ROS in vitro, zacznij od hodowli organoidów 3D w jelitach myszy. Te organoidy wykazują architekturę nabłonka jelitowego z wypukłościami przypominającymi kryptę, w których znajdują się komórki macierzyste wyrażające zieloną fluorescencję. Zawierają również zróżnicowane komórki przypominające kosmki na obrzeżach, otaczające centralne światło zawierające martwe komórki i szczątki. Wszystkie te komórki wytwarzają różne poziomy ROS.
Teraz potraktuj organoidy w wyznaczonych studzienkach modulatorami ROS. W zależności od ich charakteru, modulatory mogą działać jako induktory lub inhibitory ROS. Po inkubacji przez wymagany czas usuń zużyte podłoże.
Dodaj enzym proteolityczny do hodowli, zaburzając architekturę 3D organoidów i uwalniając różne komórki w zawiesinie. Następnie dodaj czułą na ROS sondę fluorogeniczną i inkubuj.
Po wejściu do komórek sondy reagują z ROS i utleniają się, wytwarzając czerwoną fluorescencję. Potraktuj komórki DAPI - barwnikiem fluorescencyjnym wiążącym DNA - kt
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych