JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:29 min • July 8th, 2025
Komórki jelitowe wytwarzają reaktywne formy tlenu - ROS. Umiarkowane poziomy ROS utrzymują homeostazę komórkową, podczas gdy wysokie poziomy ROS mogą powodować śmierć komórki.
Aby określić ilościowo poziomy ROS in vitro, zacznij od hodowli organoidów 3D w jelitach myszy. Te organoidy wykazują architekturę nabłonka jelitowego z wypukłościami przypominającymi kryptę, w których znajdują się komórki macierzyste wyrażające zieloną fluorescencję. Zawierają również zróżnicowane komórki przypominające kosmki na obrzeżach, otaczające centralne światło zawierające martwe komórki i szczątki. Wszystkie te komórki wytwarzają różne poziomy ROS.
Teraz potraktuj organoidy w wyznaczonych studzienkach modulatorami ROS. W zależności od ich charakteru, modulatory mogą działać jako induktory lub inhibitory ROS. Po inkubacji przez wymagany czas usuń zużyte podłoże.
Dodaj enzym proteolityczny do hodowli, zaburzając architekturę 3D organoidów i uwalniając różne komórki w zawiesinie. Następnie dodaj czułą na ROS sondę fluorogeniczną i inkubuj.
Po wejściu do komórek sondy reagują z ROS i utleniają się, wytwarzając czerwoną fluorescencję. Potraktuj komórki DAPI - barwnikiem fluorescencyjnym wiążącym DNA - który selektywnie barwi jądra martwych komórek - tworząc kontrast z żywymi komórkami.
Za pomocą cytometru przepływowego przeanalizuj żywe komórki ujemne DAPI, aby uzyskać czerwony sygnał fluorescencyjny odpowiadający ich poziomowi ROS. W zależności od charakteru modulatorów, induktory zwiększają poziomy ROS, podczas gdy inhibitory je obniżają.
Dodać 1 mikrolitr roztworu podstawowego N-acetylocysteiny do studzienek kontroli ujemnej 96-dołkowej płytki okrągłodennej zawierającej organoidy.
Po 1-godzinnej inkubacji dodać 1 mikrolitr roztworu podstawowego wodoronadtlenku tert-butylu do odpowiednich studzienek i inkubować przez 30 minut. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, usuń pożywkę bez naruszania dołączonego BMM i przenieś ją na inną 96-dołkową płytkę okrągłodenną. Odłóż ten talerz na bok.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów trypsyny i za pomocą pipety wielokanałowej pipetuj pięć razy w górę iw dół, aby zniszczyć BMM. Po krótkiej, 5-minutowej inkubacji należy oddzielić organoidy, pipetując w górę i w dół po raz drugi.
Zakręć płytką i wyrzuć supernatant, odwracając płytkę. Dodać pożywkę wcześniej zebraną na innej 96-dołkowej płytce, z powrotem do odpowiednich dołków i ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół pięć razy.
Następnie dodaj 1 mikrolitr sondy fluorogenicznej i inkubuj przez 30 minut. Następnie ponownie obróć płytkę i ponownie zawieś ogniwa z 250 mikrolitrami roztworu DAPI. Przenieść próbki w probówkach do cytometrii przepływowej i trzymać probówki na lodzie.
Zoptymalizuj ustawienia napięcia rozproszenia do przodu i bocznego dla niebarwionych napięć kontrolnych i laserowych dla każdego fluoroforu przy użyciu monobarwionych próbek. Następnie, stosując odpowiednią strategię bramkowania, zbierz minimum 20 000 zdarzeń.