Test SUMOylacji: technika in vitro do wykrywania stanu SUMOylacji białek substratowych za pomocą immunoblottingu

SUMOylacja zachodzi w wyniku przyłączenia małych modyfikatorów podobnych do ubikwityny, SUMO, do białek substratowych.

SUMOylacja zachodzi, gdy dojrzały peptyd SUMO jest aktywowany przez enzym - E1. Po aktywacji SUMO jest przenoszone do miejsca aktywnego enzymu sprzężającego - E2 - przyłączając SUMO do reszty lizyny białka substratowego. Inna ligaza - E3 - zwiększa wydajność tej interakcji.

Aby przeprowadzić test SUMOylacji in vitro, należy rozpocząć od probówki zawierającej mieszaninę białka substratowego - p53, enzymów i peptydów SUMO, a następnie inkubować w celu indukcji SUMOylacji. Uzupełnij probówkę dodecylosiarczanem sodu - buforem zawierającym SDS, kończąc reakcję. Podgrzać próbkę w celu denaturacji białek.

Załaduj mieszankę białkową do studzienki żelu SDS-PAGE i wykonaj elektroforezę. Białka SUMOylowane o wyższej masie cząsteczkowej poruszają się wolniej niż ich warianty bez SUMOylowane, generując dwa odrębne prążki.

Przenieść żel na membranę bibułową znajdującą się na mokrej bibule filtracyjnej w aparacie do elektrobibuły. Przykryj mokrą bibułą filtracyjną i przenieś elektrolitycznie białka z żelu na membranę.

Potraktuj błonę przeciwciałami anty-p53, które wiążą się z p53. Nakładka z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z enzymami, które wiążą się z kompleksami przeciwciało-p53. Dodaj podłoże chemiluminescencyjne, aby wygenerować produkt luminescencyjny i zobrazować membranę.

Pasmo o wyższej masie cząsteczkowej odpowiada białkom SUMOylowanym, podczas gdy dolne pasmo odpowiada wariantom białek nie-SUMOylowanych.

Dodać 3 mikrolitry po 100 nanogramów na mikrolitr oczyszczonego tag-K-bZIP w reakcji mieszania głównego SUMOylacji in vitro. Następnie delikatnie wymieszaj zawartość mieszanki wzorcowej i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 3 godziny.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów 2x SDS-PAGE z buforem ładującym, aby zatrzymać reakcję. Następnie podgrzewaj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 5 minut, aby zdenaturować białko.

Następnie załaduj 20 mikrolitrów próbki na 10% żel SDS-PAGE i uruchom żel pod napięciem 80 woltów przez około 120 minut, aż barwnik dotrze do dna żelu.

Po zakończeniu elektroforezy odłączyć aparat żelowy i przenieść żel do półsuchego buforu transferowego na 5 minut. Następnie zanurz membranę PVDF w innym pojemniku wypełnionym metanolem na 1 minutę.

Usunąć membranę PVDF z metanolu i zanurzyć w półsuchym buforze transferowym. Następnie delikatnie mieszaj membranę przez 5 minut.

Zdjąć pokrywę zabezpieczającą półsuchego aparatu elektroforetycznego. Wstępnie zwilż bibułę filtracyjną i przygotuj żelową kanapkę na dnie anody platynowej. Po zamocowaniu płytki katodowej w pokrywie bezpieczeństwa, uruchom blot przy stałym prądzie 15 V przez 90 minut. Następnie należy wyłączyć zasilanie i wyjąć membranę PVDF, po odłączeniu aparatu półsuchego.

Teraz zablokuj membranę PVDF buforem blokującym na 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obrotów na minutę. Następnie zhybrydyzować membranę PVDF z przeciwciałem anty-p53 i buforem blokującym przez 12 do 16 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza, na mieszalniku zawiesinowym z prędkością 30 obrotów na minutę.

Następnie wyjmij membranę PVDF i przenieś do pojemnika wypełnionego solą fizjologiczną buforowaną TRIS z Tween-20. Następnie zanurz membranę PVDF w buforowanej przez TRIS soli fizjologicznej z Tween-20 przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 45 obrotów na minutę. Następnie hybrydyzować membranę PVDF z przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową rozcieńczoną w buforze blokującym, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na mieszalniku zawiesinowym z prędkością 30 obrotów na minutę.

Następnie przemyć membranę PVDF trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną TRIS za pomocą Tween-20. Po umyciu zanurzyć membranę PVDF w buforowanym przez TRIS roztworze soli fizjologicznej Tween-20 na 30 minut na mieszalniku zawiesiny z prędkością 45 obrotów na minutę. Następnie zastąp buforowaną przez TRIS sól fizjologiczną Tween-20 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, aby zachować membranę PVDF w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez maksymalnie 12 godzin.

Następnie wymieszaj ulepszone odczynniki substratu chemiluminescencyjnego 1 i 2 w stosunku 1:1. Następnie usuń membranę PVDF z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i krótko osusz kieszeniami na dziurki, aby wchłonąć nadmiar wilgoci.

Natychmiast dodaj 400 mikrolitrów odczynnika chemiluminescencyjnego na powierzchnię membrany i odczekaj od 3 do 5 minut. Krótko osuszyć, aby odsączyć nadmiar odczynnika chemiluminescencyjnego, zapobiegając całkowitemu wyschnięciu membrany. Użyj systemu obrazowania luminescencyjnego, aby naświetlić plamę.