Test SUMOylacji: technika in vitro do wykrywania stanu SUMOylacji białek substratowych za pomocą immunoblottingu

SUMOylacja zachodzi w wyniku przyłączenia małych modyfikatorów podobnych do ubikwityny, SUMO, do białek substratowych.

SUMOylacja zachodzi, gdy dojrzały peptyd SUMO jest aktywowany przez enzym - E1. Po aktywacji SUMO jest przenoszone do miejsca aktywnego enzymu sprzężającego - E2 - przyłączając SUMO do reszty lizyny białka substratowego. Inna ligaza - E3 - zwiększa wydajność tej interakcji.

Aby przeprowadzić test SUMOylacji in vitro, należy rozpocząć od probówki zawierającej mieszaninę białka substratowego - p53, enzymów i peptydów SUMO, a następnie inkubować w celu indukcji SUMOylacji. Uzupełnij probówkę dodecylosiarczanem sodu - buforem zawierającym SDS, kończąc reakcję. Podgrzać próbkę w celu denaturacji białek.

Załaduj mieszankę białkową do studzienki żelu SDS-PAGE i wykonaj elektroforezę. Białka SUMOylowane o wyższej masie cząsteczkowej poruszają się wolniej niż ich warianty bez SUMOylowane, generując dwa odrębne prążki.

Przenieść żel na membranę bibułową znajdującą się na mokrej bibule filtracyjnej w aparacie do elektrobibuły. Przykryj mokrą bibułą filtracyjną i przenieś elektrolitycznie białka z żelu na membranę.

Potraktuj błonę przeciwciałami anty-p53, które wiążą się z p53