JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:11 min. • July 8th, 2025
Podczas zakażenia koronawirusem zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 lub SARS-CoV-2 domena wiążąca receptor białka kolca wirusa, RBD, wiąże się z enzymem konwertującym angiotensynę 2 w komórce gospodarza, ACE2, ułatwiając wnikanie do komórek wirusa. W odpowiedzi układ odpornościowy wytwarza przeciwciała, które wiążą się z wirusowym RBD i zapobiegają wnikaniu do komórek, zmniejszając zakaźność wirusa.
Aby wykryć przeciwciała SARS-CoV-2 skierowane przeciwko RBD, należy pobrać rekombinowaną zawiesinę bioreporterową składającą się z małych fragmentów białka, połączonych z RBD kolca SARS-CoV-2. Dodaj standardowe przeciwciała SARS-CoV-2 skierowane przeciwko RBD i kulki magnetyczne wiążące przeciwciała.
Podczas inkubacji region przeciwciała Fc wiąże się z domenami wiążącymi Fc kulek. Dodatkowo rekombinowany bioreporter wiąże się z przeciwciałami SARS-CoV-2 skierowanymi do RBD związanych z kulkami.
Po inkubacji odwirować mieszaninę. Usunąć niezwiązany supernatant zawierający bioreporter. Ponownie zawiesić powiązane ściegi w buforze. Przenieść na płytkę wielodołkową.
Dodać roztwór zawierający fragmenty białkowe o dużych rozmiarach, mające wysokie powinowactwo do fragmentów białkowych o małych rozmiarach. Duże i małe fragmenty białek wiążą się ze sobą, tworząc aktywny, zmodyfikowany enzym lucyferazy.
Dodaj furimazynę, substrat lucyferazy. Lucyferazy katalizuje utlenianie furimazyny, powodując emisję światła. Za pomocą luminometru zmierz luminescencję, wskazującą na obecność przeciwciał neutralizujących.
Wysokie natężenie sygnału sugeruje wysokie stężenia przeciwciał SARS-CoV-2 skierowanych przeciwko RBD.
W celu wykonania testu wykrywania przeciwciał HiBiT-RBD należy przygotować bioreporter HiBiT-RBD i połączyć 50 mikrolitrów supernatantu zawierającego HiBiT-RBD z 1 mikrogramem komercyjnego przeciwciała SARS-CoV-2-RBD w mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra.
Do roztworu dodać 20 mikrolitrów białka wiążącego immunoglobuliny lub białka G. Zwiększ całkowitą objętość do 300 mikrolitrów, dodając PBS. Inkubować probówki na wytrząsarce probówkowej lub rotatorze przez 30 minut, odwirować przy 12 000 x g przez 30 sekund, następnie wyrzucić supernatant i przemyć PBS. Powtórz proces trzy razy, aby usunąć wolny HiBiT-RBD.
Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach PBS i przenieść je na 96-dołkową płytkę. Dodaj 50 mikrolitrów 1x LgBiT i odczekaj 5 minut. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 1x substratu NanoLuc. Natychmiast odczytaj sygnał luminescencji za pomocą luminometru.