Fluorescencyjny test paraliżu reporterowego: technika oceny związanego z wiekiem postępującego tworzenia się fluorescencyjnego reportera poliglutaminy i związanego z nim paraliżu w Caenorhabditis elegans

Homeostaza białek komórkowych lub proteostaza obejmuje regulację fałdowania i funkcji białek, a także degradację nieprawidłowo sfałdowanych białek. Podczas starzenia się maszyneria proteostazy zmniejsza się, powodując gromadzenie się i dalszą agregację nieprawidłowo sfałdowanych białek, co prowadzi do dysfunkcji komórek.

Aby określić związany z wiekiem spadek proteostazy, zacznij od zsynchronizowanych rozwojowo, dorosłych transgenicznych Caenorhabditis elegans.

Komórki mięśniowe tych robaków wyrażają białka z nieprawidłowo rozprężonymi powtórzeniami poliglutaminy lub polyQ, połączonymi ze znacznikiem fluorescencyjnym. Białka PolyQ są podatne na nieprawidłowe fałdowanie, a zatem po akumulacji mogą tworzyć agregaty.

Przenieść robaki na szkiełko mikroskopowe zawierające podkładkę agarozową i unieruchomić odpowiednią substancją chemiczną do obrazowania żywych komórek. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wizualizuj mięśnie ścian ciała robaków w pewnym okresie czasu, aby określić jasne, fluorescencyjne sygnały ognisk, odpowiadające fluorescencyjnym agregatom polyQ.

W ciągu kilku dni, ze względu na spadek proteostazy związany z wiekiem, dochodzi do postępującej akumulacji agregatów polyQ, co prowadzi do większej liczby ognisk fluorescencyjnych. Zwiększone agregaty polyQ w komórkach mięśniowych powodują toksyczność i zakłócają funkcjonowanie komórek mięśniowych, powodując paraliż.

Pod mikroskopem zarejestruj liczbę żywych, sparaliżowanych robaków, którym brakuje ruchu pod wpływem bodźców mechanicznych. Zwiększony wskaźnik paraliżu robaków sugeruje związany z wiekiem spadek proteostazy tkanki mięśniowej u robaków.

Aby zmierzyć spadek proteostazy w tkance mięśniowej, wybierz 20 zwierząt i zamontuj je na szkiełku mikroskopowym z 3% podkładką agarozową i 5-mikrolitrową kroplą 10-milimolowego azydku sodu.

Po unieruchomieniu wszystkich robaków wyobraź sobie całe ciała zwierząt za pomocą soczewki o 10-krotnym powiększeniu. Użyj filtra FITC lub YFP i tej samej ekspozycji dla każdego zwierzęcia. Po zakończeniu wyrzuć slajdy.

Policz liczbę ognisk w mięśniach ściany ciała całego zwierzęcia. Ogniska to jaśniejsze, przerywane sygnały, które można odróżnić od ciemniejszego sygnału rozpuszczalnego w tle.

W dniach, w których zdobywano punkty, spójrz na tabliczki ze zwierzętami i zapisz liczbę sparaliżowanych zwierząt. Następnie usuń sparaliżowane zwierzęta z talerza.

Po zakończeniu eksperymentu oblicz współczynnik paraliżu dla każdego stanu i wykreśl postęp paraliżu.