Amplifikowany luminescencyjny test jednorodny zbliżeniowy: Test zbliżeniowy oparty na kulkach do badania przesiewowego małych cząsteczek hamujących interakcje białko-białko

W systemach biologicznych bliskość białka do jego specyficznego partnera jest kluczowym wyznacznikiem udanej interakcji białko-białko. Przy obecności małych cząsteczek hamujących białka te nie mogą się do siebie zbliżać, zakłócając ich interakcje.

Aby przebadać cząsteczki hamujące pod kątem zakłócania interakcji między dwoma białkami - opiekuńczym i ko-opiekuńczym - weź wielodołkową płytkę zawierającą różne małe cząsteczki. Uzupełnij studzienki koralikami donorowymi z ko-chaperonami przymocowanymi do ich powierzchni. Koraliki te zawierają fotouczulacze do oznaczania chemiluminescencji.

Dodaj zawiesinę kulek akceptorowych sprzężonych z sekwencjami peptydowymi pochodzącymi z białka opiekuńczego, które wiążą się specyficznie z ko-chaperonem. Koraliki zawierają barwnik na bazie tioksenu i fluorofory niezbędne do wizualizacji.

W studzienkach z cząsteczkami niehamującymi wysokie powinowactwo między peptydami wiążącymi białka opiekuńcze a koopiekuńczymi przyciąga kulki akceptorowe i donorowe. Podczas gdy kulki pozostają daleko, gdy obecne są inhibitory.

Korzystając z czytnika chemiluminescencyjnego, zbadaj interakcję. Po oświetleniu określoną długością fali, fotouczulacze kulkowe donorowe emitują wysoce reaktywne tleny singletowe.

Bez cząsteczek hamujących emitowane gatunki docierają do blisko proksymalnie położonych kulek akceptorowych i reagują z cząsteczkami barwnika, powodując chemiluminescencję. Energia ta aktywuje fluorofory kulek akceptorowych, powodując emisję światła.

Natomiast w studzienkach z cząsteczkami hamującymi tleny singletowe ulegają rozpadowi, co prowadzi do braku emisji światła, co wskazuje na skuteczne hamowanie interakcji białko-białko.

Dodaj kulki donorowe glutationu w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr w PBS. Dodaj GST-FKBP51 do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr i inkubuj reakcję przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności.

Wykonać seryjne rozcieńczenia badanego związku w DMSO. Dodać 0,25 mikrolitra rozcieńczeń badanego związku w trzech powtórzeniach, w rogu każdego dołka płytki 384-dołkowej.

W celu kontroli ujemnej dodaj 0,25 mikrolitra DMSO, a w celu kontroli pozytywnej dodaj 0,25 mikrolitra peptydu C-końcowego Hsp90 w studzienkach.

Do każdej studzienki dodać 22,5 mikrolitra roztworu zawierającego kulki donorowe glutationu z białkami oznaczonymi GST. Dokładnie potrząśnij płytką rękami i inkubuj w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Rozcieńczyć kulki akceptora dołączonym peptydem C-końcowym Hsp90 do stężenia 100 mikrogramów na mililitr w 0,5x PBS. Dodaj 2,25 mikrolitra rozcieńczonych koralików akceptorowych do każdej studzienki. Wstrząsnąć i inkubować płytkę w ciemności przez 15 minut, jak pokazano.

Włącz czytnik płytek, zmierz sygnał tabliczki i przeanalizuj dane zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym.