JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:43 min • July 8th, 2025
Na początek przygotuj seryjne rozcieńczenia wirusa opryszczki pospolitej, zakaźnego wirusa otoczkowego, w buforze.
Otrzymać płytkę wielodołkową zawierającą monowarstwę podatnej na wirusy hodowli komórek nabłonka. Zastąp określoną objętość pożywki rozcieńczonymi zawiesinami wirusowymi, zapewniając równomierne pokrycie monowarstwowe. Pozwól wirusowi zaadsorbować się na powierzchni komórki.
Usuń wszelkie niezainfsorbowane wirusy. Przykryj monowarstwę ogniwa pożywką zawierającą metylocelulozę, tworząc półstałą powłokę.
Podczas inkubacji otoczka wirusa i błona komórkowa łączą się, uwalniając wirusowy nukleokapsyd otaczający dwuniciowy genom do cytoplazmy. Co więcej, genom wirusa jest uwalniany do jądra komórkowego.
Wykorzystując maszynerię komórkową gospodarza i białko wirionowe, genom wirusa wykazuje natychmiastową ekspresję wczesnych białek wirusowych, które regulują ekspresję wczesnych genów. Wczesne białka wirusowe pośredniczą w replikacji wirusowego DNA.
Następnie późne geny wirusa wyrażają białka strukturalne, które wraz z genomem wirusa łączą się, tworząc cząstki rodu wirionowego. Komórki zakażone wirusem ulegają lizie, uwalniając wiriony.
Metyloceluloza ogranicza ruch wirusa, powodując, że wiriony infekują tylko sąsiednie komórki, a następnie liza, tworząc w monowarstwie.
Po inkubacji usunąć nakładkę metylocelulozy. Dodaj etanolowy roztwór fioletu krystalicznego. Etanol utrwala komórki i dezaktywuje wirusy, podczas gdy fiolet krystaliczny barwi komórki. W rezultacie na monowarstwie fioletowych komórek pojawiają się przezroczyste strefy lizy lub blaszki.
Policz blaszki w każdym studzienku przy każdym rozcieńczeniu wirusa, aby określić miano lub stężenie zakaźnego wirusa.
Usuń pożywkę do hodowli komórkowych z jednego lub dwóch dołków za pomocą pipety. Ostrożnie dodawać rozcieńczoną próbkę wirusa kroplami do każdej monowarstwy komórek, kroplami przez bok każdej studzienki.
Powtarzaj proces dla każdego jednego lub dwóch dołków, aż cała płytka zostanie wypełniona próbkami wirusa, które są platerowane. Delikatnie kołysz ręcznie całą płytkę.
Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 godzinę, aby umożliwić adsorpcję wirusa. Po każdych 10 minutach wyjmuj płytkę z inkubatora, delikatnie kołysz nią ponownie, aby wirus rozprowadził się bardziej równomiernie w każdym dołku, a następnie umieść ją z powrotem w inkubatorze.
Aby zmniejszyć możliwość przypadkowego zliczenia niewchłoniętego inokulum, należy usunąć próbkę wirusa ze studzienek za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów i wyrzucić próbkę do zlewki na odpady.
Umieść 2,5 mililitra nakładki metylocelulozowej na płytce i umieść ją z powrotem w inkubatorze. Zdezynfekuj zlewkę na odpady, zwykle z dodatkiem wybielacza, jodoforu lub podobnego środka wirusobójczego, przed wyjęciem jej z szafki bezpieczeństwa biologicznego.
Po dwudniowej inkubacji usunąć nakładkę metylocelulozy z jednego lub dwóch dołków na raz za pomocą pipety i umieścić ją w zlewce na odpady. Dodaj około 2 mililitry 1% fioletu krystalicznego i 50% etanolu do każdej studzienki. Inkubuj płytkę ze wszystkimi studzienkami wypełnionymi plamą przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
W tym momencie zdezynfekować zlewkę na odpady, jak pokazano wcześniej. Energicznie umyj talerze wodą z kranu, aż spływ będzie czysty.
Upewnij się, że istnieją około 10-krotne różnice w liczbie blaszek w każdej serii rozcieńczeń.