JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:32 min • July 8th, 2025
Komórki gospodarza zakażone patogenami mikrobiologicznymi ulegają apoptozie - zaprogramowanej śmierci komórki. Podczas apoptozy DNazy degradują chromosomalne DNA na małe fragmenty, prowadząc do śmierci komórki.
Aby wykryć apoptozę za pomocą testu TUNEL, należy pobrać szklane szkiełko z odparafinowanym i uwodnionym fragmentem tkanki skórnej zakażonym patogenem grzybiczym.
Potraktuj tkankę proteinazą-K, aby dezaktywować komórkowe DNazy, zapobiegając ich potencjalnej degradacji DNA podczas analizy. Dodaj nadtlenek wodoru, aby wygasić reakcję i umyj szkiełko, aby usunąć nieprzereagowaną proteinazę-K.
Dodać bufor zawierający trifosforany deoksyurydyny znakowane digoksygeniną lub dUTP. Uzupełnij go końcową deoksynukleotydylotransferazą, enzymem TdT i inkubuj. W komórkach apoptotycznych enzym TdT katalizuje przyłączanie znakowanych dUTP do odsłoniętych grup 3′-hydroksylowych fragmentowanego DNA.
Następnie dodaj przeciwciało anty-digoksygeniny sprzężone z reporterem rodaminy i inkubuj je w ciemności, aby ułatwić wiązanie przeciwciał z dUTP znakowanymi digoksygeniną, nadając czerwoną fluorescencję podczas obrazowania.
Potraktuj próbki tkanek fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym, aby uwidocznić jądra. Umieść szkiełko nakrywkowe na wycinku tkanki i zwizualizuj go pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Niebieska fluorescencja pomaga zidentyfikować jądra wszystkich komórek w sekcji tkanki, podczas gdy obecność czerwonej fluorescencji w komórkach barwionych rodaminą wskazuje na fragmentację DNA spowodowaną apoptozą.
Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować szkiełka hydrofilowe z próbką tkanki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Aby odparafinować skrawki tkanki, umyj szkiełka trzykrotnie ksylenem, po 5 minut każde, w słoiku z kopeliną. Następnie umyj szkiełka 100% etanolem dwa razy po 5 minut każde. Następnie umyj szkiełka 95% etanolem i 70% etanolem przez 3 minuty każde, a następnie umyj szkiełka raz PBS przez 5 minut.
Aby przygotować szkiełka do badań eksperymentalnych i kontroli ujemnej, należy poddać tkankę wstępnej obróbce, dodając świeżo rozcieńczoną proteinazę K bezpośrednio do szkiełek. Inkubować szkiełka przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyć szkiełka w PBS dwa razy po 2 minuty każde.
Aby przygotować szkiełka kontroli pozytywnej, należy wstępnie potraktować tkankę buforem DN, a następnie inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie rozpuścić DNazę I w buforze DN do końcowego stężenia 0,1 mikrograma na mililitr. Dodaj przygotowany roztwór DNA do szkiełek. Inkubuj szkiełka przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyj boki wodą destylowaną w słoiku z kopeliną pięć razy, po 3 minuty każde.
Schłodzić reakcję w 3% nadtlenku wodoru w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka w PBS dwa razy po dwie minuty każde. Następnie dodaj bufor równowagi do tkanki na szkiełkach. Inkubować przez 10 sekund w temperaturze pokojowej, a następnie strzepnąć nadmiar płynu wokół części tkanki.
Rozcieńczyć końcowy enzym deoksynukleotydylotransferazy w buforze reakcyjnym, a następnie dodać go do tkanki na szkiełkach eksperymentalnych i kontroli pozytywnej. Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie umieścić szkiełka w słoiku z kopiną zawierającym stężenie robocze buforu zatrzymującego. Mieszać przez 15 sekund, a następnie inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umyj szkiełka PBS trzy razy po 1 minutę i strzepnij nadmiar płynu.
Następnie dodaj koniugat anty-digoksygeniny wstępnie podgrzany do temperatury pokojowej bezpośrednio na tkankę. Inkubuj szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej ciemnej komorze.
Po zakończeniu inkubacji przemyć szkiełka czterokrotnie PBS przez dwie minuty każde. Strzepnij nadmiar płynu. Następnie dodaj podłoże montażowe po bokach. Dodać 15 mikrolitrów roztworu DAPI do podłoża montażowego na szkiełkach. Przykryj każde szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w ciemności.
Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego obserwuj szkiełka natychmiast po zakończeniu procesu barwienia.
Rób zdjęcia 400 razy w losowych odstępach wzdłuż każdej sekcji skóry. Policz niebieskie komórki wybarwione DAPI, aby upewnić się, że widocznych jest co najmniej 100 komórek na odcinek skóry na zwierzę. Następnie policz liczbę komórek TUNEL-dodatnich, które pojawiają się jako czerwone pojedyncze komórki z wyraźnymi krawędziami komórek.