JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:32 min. • July 8th, 2025
Komórki gospodarza zakażone patogenami mikrobiologicznymi ulegają apoptozie - zaprogramowanej śmierci komórki. Podczas apoptozy DNazy degradują chromosomalne DNA na małe fragmenty, prowadząc do śmierci komórki.
Aby wykryć apoptozę za pomocą testu TUNEL, należy pobrać szklane szkiełko z odparafinowanym i uwodnionym fragmentem tkanki skórnej zakażonym patogenem grzybiczym.
Potraktuj tkankę proteinazą-K, aby dezaktywować komórkowe DNazy, zapobiegając ich potencjalnej degradacji DNA podczas analizy. Dodaj nadtlenek wodoru, aby wygasić reakcję i umyj szkiełko, aby usunąć nieprzereagowaną proteinazę-K.
Dodać bufor zawierający trifosforany deoksyurydyny znakowane digoksygeniną lub dUTP. Uzupełnij go końcową deoksynukleotydylotransferazą, enzymem TdT i inkubuj. W komórkach apoptotycznych enzym TdT katalizuje przyłączanie znakowanych dUTP do odsłoniętych grup 3′-hydroksylowych fragmentowanego DNA.
Następnie dodaj przeciwciało anty-digoksygeniny sprzężone z reporterem rodaminy i inkubuj je w ciemności, aby ułatwić wiązanie przeciwciał z dUTP znakowanymi digoksygeniną, nadając czerwoną fluorescencję podczas obrazowania.
Potraktuj próbki tkanek fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym, aby uwidocz
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych