JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:54 min. • July 8th, 2025
Kaspaza-3 i kaspaza-7 to proteazy, które rozpoznają sekwencję tetrapeptydu DEVD w białkach docelowych, rozszczepiając je na C-końcu reszty kwasu asparaginowego. Odgrywają one znaczącą rolę w apoptozie - programowanej śmierci komórki - kaskadzie.
Aby ocenić aktywność kaspazy-3/7 w komórkach apoptotycznych, zacznij od rurki zawierającej eksplant skóry żabiego palca u nogi zakażony grzybami indukującymi apoptozę. Dodaj odpowiedni bufor do probówki i kilka metalowych koralików.
Użyj bicia koralików, aby rozbić komórki skóry i uwolnić zawartość komórkową, w tym białka kaspazy-3/7. Odwirować probówkę, granulując resztki komórek i organelle. Odessać bogaty w białko supernatant z probówki i pipety do studzienek płytki do oznaczania wielodołkowego.
Uzupełnij studzienki luminogennym odczynnikiem kaspazy. Ten odczynnik składa się z proluminescencyjnego substratu zawierającego peptyd DEVD w buforowanym roztworze zawierającym ATP, jony magnezu i enzym lucyferazy.
Wymieszaj zawartość studzienki i inkubuj. Podczas inkubacji kaspaza-3/7 rozszczepia podłoże proluminescencyjne, uwalniając aminolucyferynę - substrat dla lucyferazy - do roztworu.
W obecności jonów ATP i magnezu lucyferazy utlenia uwol
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych