JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:54 min • July 8th, 2025
Kaspaza-3 i kaspaza-7 to proteazy, które rozpoznają sekwencję tetrapeptydu DEVD w białkach docelowych, rozszczepiając je na C-końcu reszty kwasu asparaginowego. Odgrywają one znaczącą rolę w apoptozie - programowanej śmierci komórki - kaskadzie.
Aby ocenić aktywność kaspazy-3/7 w komórkach apoptotycznych, zacznij od rurki zawierającej eksplant skóry żabiego palca u nogi zakażony grzybami indukującymi apoptozę. Dodaj odpowiedni bufor do probówki i kilka metalowych koralików.
Użyj bicia koralików, aby rozbić komórki skóry i uwolnić zawartość komórkową, w tym białka kaspazy-3/7. Odwirować probówkę, granulując resztki komórek i organelle. Odessać bogaty w białko supernatant z probówki i pipety do studzienek płytki do oznaczania wielodołkowego.
Uzupełnij studzienki luminogennym odczynnikiem kaspazy. Ten odczynnik składa się z proluminescencyjnego substratu zawierającego peptyd DEVD w buforowanym roztworze zawierającym ATP, jony magnezu i enzym lucyferazy.
Wymieszaj zawartość studzienki i inkubuj. Podczas inkubacji kaspaza-3/7 rozszczepia podłoże proluminescencyjne, uwalniając aminolucyferynę - substrat dla lucyferazy - do roztworu.
W obecności jonów ATP i magnezu lucyferazy utlenia uwolnioną aminolucyferynę, wytwarzając produkt bioluminescencyjny. Ilość światła wytwarzanego podczas reakcji jest proporcjonalna do aktywności kaspazy.
Aby wyekstrahować białka z zamrożonej próbki palca żaby, umieść próbkę w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej z nakrętką gwintowaną, zawierającej 100 mikrolitrów buforu próbki i dwa koraliki ze stali nierdzewnej.
Użyj ubijaka do kulek z maksymalną prędkością, aby zlizować komórki. Następnie umieść probówkę na lodzie na 3 minuty, a następnie odwiruj probówkę, aby zebrać supernatant.
Aby wykonać test kaspazy 3/7 na 384-dołkowej płytce, dodaj 10 mikrolitrów buforu próbki jako ślepą próbę i 10 mikrolitrów ekstraktu białkowego w trzech powtórzeniach. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów dostępnego w handlu odczynnika kaspazy 3/7 do ekstraktu białkowego i ślepych studzienek. Następnie delikatnie potrząsaj płytką przez 15 sekund, aby wymieszać dwa odczynniki.
Inkubować w temperaturze pokojowej i ciemności przez 30 minut. Na koniec użyj czytnika płytek luminescencyjnych, aby zmierzyć luminescencję próbki.