JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 7:16 min • July 8th, 2025
Oocyty w profazie I mejozy są aktywne transkrypcyjnie; wytwarzają mRNA i przechowują je w formie uśpionej. Podczas dojrzewania, gdy oocyt wchodzi w metafazę, zmagazynowane mRNA są przekształcane w białka.
Aby zbadać translację mRNA, zacznij od oocytów myszy zatrzymanych w profazie I zawieszonych w kropli pożywki. Umieść pipetę podtrzymującą w pobliżu pojedynczego oocytu, aby utrzymać ją na miejscu.
Pobrać pipetę do mikroiniekcji zawierającą mieszaninę reporterową. Ta mieszanina zawiera dwa różne typy mRNA, jeden kodujący żółte białko fluorescencyjne lub YFP - reporter połączony z nieulegającym translacji regionem 3' docelowego genu - oraz poliadenylowane mRNA kodujące białko czerwonej fluorescencji.
Wstrzyknąć mieszaninę reporterową do oocytu. Inkubować mikrowstrzyknięte oocyty w pożywce do dojrzewania uzupełnionej cilostamidem - inhibitorem chemicznym, który utrzymuje zatrzymanie profazy-I.
Oocyt transluje poliadenylowane mRNA, aż intensywność czerwonej fluorescencji osiągnie plateau, podczas gdy poziomy mRNA kodującego YFP bez ogona poliadenylacji pozostają takie
.Przenieś leczone oocyty do pożywki dojrzewającej bez cylostamidu, co pomaga wznowić mejozę, a docelowe mRNA przechodzi translację w celu wytworzenia docelowego białka połączonego z żółtym reporterem fluorescencyjnym.
Wykonaj obrazowanie poklatkowe, aby uwidocznić sygnały fluorescencyjne w regularnych odstępach czasu.
Wstrzyknięte oocyty wykazują stały poziom czerwonej fluorescencji, podczas gdy żółta fluorescencja wzrasta z czasem, co wskazuje na translację i stopniową akumulację białek reporterowych.
Na początek ostrożnie otwórz mieszki antralne, wykonując małe nacięcie w ścianie mieszków włosowych za pomocą igły o rozmiarze 26. Odizoluj nienaruszone COC za pomocą kilku warstw komórek wzgórka za pomocą szklanej pipety obsługiwanej przez usta. Użyj mniejszej pipety i mechanicznie usuń COC przez wielokrotne pipetowanie.
Odessać ogołocone oocyty i umieścić je na szalce Petriego z pożywką do dojrzewania uzupełnioną 1 mikromolem cylostamidu. Umieść naczynie w inkubatorze na dwie godziny, aby oocyty mogły zregenerować się po stresie wywołanym ich izolacją od pęcherzyków.
Umieść 10-centymetrową rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego i mechaniczny ściągacz, aby przygotować igły iniekcyjne. Zegnij końcówkę igły pod kątem 45 stopni za pomocą podgrzanego filamentu, aby uzyskać optymalne wstrzyknięcie. Umieść 20-mikrolitrowe kropelki podstawowej pożywki do pobierania oocytów w naczyniu styropianowym i przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym.
Przygotuj większą objętość mieszanki reporterowej, dodając 12,5 mikrograma na mikrolitr Ypet UTR i mCherry każdy. Ich porcje należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu odwirować podwielokrotność przez dwie minuty przy 20 000 x g. Następnie przenieść ją do nowej probówki do mikrowirówki.
Na igłę iniekcyjną należy wlać około 0,5 mikrolitra mieszanki reporterowej. Umieścić pipetę przytrzymującą i igłę do wstrzykiwań w uchwytach i umieścić je w kropli pożywki do pobierania oocytów.
Otworzyć igłę do wstrzykiwań, delikatnie stukając nią o pipetę przytrzymującą. Umieść oocyty w kropli podstawowej pożywki do zbierania i wstrzyknij od 5 do 10 pikolitrów mieszanki reporterowej. Inkubować oocyty w pożywce dojrzewającej z 1 mikromolowym cilostamidem przez 16 godzin, aby sygnał mCherry ustabilizował się.
W przypadku mikroskopii poklatkowej należy przygotować szalkę Petriego z dwiema 20-mikrolitrowymi kropelkami pożywki dojrzewającej dla każdego wstrzykniętego reportera. Jedna kropla z 1 mikromolowym cylostamidem do kontroli oocytów zatrzymanych przez profazę I i jedna kropla bez cylostamidu do dojrzewania oocytów. Przykryj kropelki lekkim olejem mineralnym i umieść je w inkubatorze.
Po wstępnej inkubacji należy wyjąć wstrzyknięte oocyty z inkubatora i przemyć je czterokrotnie w pożywce do dojrzewania bez cilostamidu. Przechowywać niektóre oocyty w pożywce do dojrzewania z 1 mikromolowym cylostamidem jako grupą kontrolną oocytów profazy I.
Przenieś wstrzyknięte oocyty do odpowiednich kropelek na wcześniej przygotowanej czaszy mikroskopu poklatkowego. Zgrupuj oocyty za pomocą zamkniętej szklanej pipety, aby zapobiec ich ruchowi podczas zapisu.
Umieść czaszę pod mikroskopem wyposażonym w system oświetlenia diodami elektroluminescencyjnymi oraz zmotoryzowany stolik wyposażony w komorę środowiskową utrzymywaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, stosując parametry wymienione w rękopisie tekstu.
Wprowadź odpowiednie ustawienia eksperymentu poklatkowego, klikając "Aplikacje", a następnie "Akwizycja wielowymiarowa". Wybierz pierwszą zakładkę "Główny" i wybierz "Poklatkowy", "Wiele pozycji stage" i "Wiele długości fal".
Wybierz zakładkę "Zapisywanie", aby wprowadzić lokalizację, w której eksperyment ma zostać zapisany. Następnie wybierz zakładkę "Time-lapse", aby wprowadzić liczbę punktów czasowych, czas trwania i przedział czasowy. Wybierz zakładkę "Etap". Włącz jasne pole i zlokalizuj położenie oocytów, otwierając nowe okno i wybierając "Pobierz", "Nabierz" i "Pokaż na żywo".
Po zlokalizowaniu oocytów przełącz się z powrotem na "Okno akwizycji wielowymiarowej" i naciśnij "+", aby ustawić lokalizację oocytów. Wybierz zakładkę "Długości fal" i ustaw trzy różne długości fal dla jasnego pola, YFP i mCherry. Dostosuj ekspozycję dla Ypet i mCherry. Następnie rozpocznij eksperyment poklatkowy, klikając "Nabierz".
W celu analizy translacji Ypet-3' UTR należy wykonać dwa pomiary regionu dla każdego oocytu. Sam oocyt poprzez przycięcie "Region elipsy" i mały obszar otaczający oocyt, który ma być użyty do odejmowania tła, klikając "Obszar prostokątny". Wyeksportuj dane pomiarowe regionu do arkusza kalkulacyjnego, klikając "Otwórz dziennik", a następnie "Dane dziennika".
Dla każdego pojedynczego oocytu i dla wszystkich zmierzonych punktów czasowych odejmij pomiar regionu tła od pomiaru regionu oocytu osobno dla długości fal YFP i mCherry.