JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 7:16 min. • July 8th, 2025
Oocyty w profazie I mejozy są aktywne transkrypcyjnie; wytwarzają mRNA i przechowują je w formie uśpionej. Podczas dojrzewania, gdy oocyt wchodzi w metafazę, zmagazynowane mRNA są przekształcane w białka.
Aby zbadać translację mRNA, zacznij od oocytów myszy zatrzymanych w profazie I zawieszonych w kropli pożywki. Umieść pipetę podtrzymującą w pobliżu pojedynczego oocytu, aby utrzymać ją na miejscu.
Pobrać pipetę do mikroiniekcji zawierającą mieszaninę reporterową. Ta mieszanina zawiera dwa różne typy mRNA, jeden kodujący żółte białko fluorescencyjne lub YFP - reporter połączony z nieulegającym translacji regionem 3' docelowego genu - oraz poliadenylowane mRNA kodujące białko czerwonej fluorescencji.
Wstrzyknąć mieszaninę reporterową do oocytu. Inkubować mikrowstrzyknięte oocyty w pożywce do dojrzewania uzupełnionej cilostamidem - inhibitorem chemicznym, który utrzymuje zatrzymanie profazy-I.
Oocyt transluje poliadenylowane mRNA, aż intensywność czerwonej fluorescencji osiągnie plateau, podczas gdy poziomy mRNA kodującego YFP bez ogona poliadenylacji pozostają takie
.Przenieś leczone oocyty do pożywki dojrzewającej bez cylostamidu, co pomaga wznowić mejozę, a docelowe mRNA przechodz
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych