JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:21 min. • July 8th, 2025
Jelito środkowe owada zawiera region komórek miedzianych - CCR - który jest odpowiedzialny za zakwaszenie jelit. Region ten zawiera wyspecjalizowane komórki wydzielnicze - komórki miedziane - które wytwarzają kwas, który przechodzi przez wąski kanał utworzony przez sąsiednie komórki śródmiąższowe. Kwas uwalnia się do światła jelita, aby wspomóc trawienie.
Aby monitorować zakwaszenie jelit u Drosophila, należy przyjmować dorosłe muchy głodzone przez odpowiedni czas. Umieść muchy na płytce Petriego zawierającej pojedynczą kroplę pokarmu dla much uzupełnionego błękitem bromofenolowym lub BPB - barwnikiem wskaźnikowym wyczuwającym pH. Pozwól wygłodzonym muchom żerować przez określony czas.
Po spożyciu pokarmu kwas wytwarzany przez komórki miedziane dociera do światła jelita i miesza się z pokarmem zawierającym BPB. Przy kwaśnym pH cząsteczki BPB ulegają protonacji, co zmienia ich kolor z niebieskiego na żółty - co wskazuje na zakwaszenie.
Po zakończeniu trwania eksperymentu umieść płytkę Petriego na lodzie. Niska temperatura zatrzymuje aktywność nerwowo-mięśniową u muszek i znieczula je. Umieść pojedynczą muchę pod mikroskopem stereoskopowym i chirurgicznie odizoluj nienaruszony przewód pokarmowy.
Zbadaj kolor CCR, aby określić stan zakwaszenia jelit. Żółte zabarwienie wskazuje na zakwaszenie, podczas gdy niebieskie zabarwienie wskazuje na brak zakwaszenia.
Sprawdź przewód pokarmowy wszystkich much i oblicz odsetek osób wykazujących zakwaszenie jelit.
Rozpocznij przygotowania do testu monitorowania zakwaszenia jelit od przygotowania pokarmu dla much z niebieskim błękitem bromofenolowym lub barwnikiem BPB wykrywającym pH. Aby to zrobić, rozpuść pokarm na muchy w kuchence mikrofalowej i pozwól mu ostygnąć, aż będzie letni. Dodaj 1 mililitr 4% BPB do 1 mililitra letniego pokarmu z dobrze mieszając. Za pomocą pipety dodaj pokarm na muchy zawierający BPB do jednej kropki o objętości około 200 mikrolitrów w środku szalki Petriego.
Następnie zbierz od 0 do 2 dni samic muchówek Drosophila melanogaster bez pierwszego tłoczenia i pozwól muchom zregenerować się na standardowym pokarmie z mąki kukurydzianej. Przed eksperymentem głodź muszki przez 24 godziny w temperaturze pokojowej w fiolce zawierającej laboratoryjną chusteczkę nasączoną około 2 mililitrami wody dejonizowanej.
Przenieś wygłodzone muchy na szalkę Petriego zawierającą pojedyncze kropki świeżo przygotowanego pokarmu dla much uzupełnionego o 2% BPB, aby umożliwić muchom żerowanie przez cztery godziny w temperaturze pokojowej, pod wpływem światła.
Po czterech godzinach zbierz muchy. Następnie przystąp do chirurgicznego izolowania wnętrzności znieczulonych much w 1x PBS za pomocą kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym. Policz liczbę much, które wykazują silne zabarwienie BPB w jelitach i oblicz procent, korzystając z równania.